资源描述：
《鹅副粘病毒NA1株主要免疫原性蛋白F基因遗传变异研究及原核表达载体的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第六届理.会第二次会议任教学专业委员会2006年会议论文集编码364个氨基酸。与国内外有代表性的NDVM基因序列相比，核昔酸序列同源性在85.40/o-97.5%之间，氨基酸序列同源性在89.70/o-98.8%之间。说明NA-1株M蛋白相对经典的新城疫已经发生了较大的变化。参考文献略鹅副粘病毒NA-1株主要免疫原性蛋白F基因遗传变异研究及原核表达载体的构建毕玉海，徐明，李志杰，常夹，黄海楠，宋子运，尹仁福，杜眉，丁壮*(吉林大学畜软兽医学院动物重要病原与疚病研究室，吉林长春，130062)摘要:参
2、考GeneBank.-表的相关鹅副粘病毒(GPMV)基因组核薯酸序列，设计并合成了一对特异性引物，采用RTPCR技术对GPMVNA-1株的F基因进行扩增，将目的基因克隆到pGEM.-T载体后测序.经序列分析、进化树分析等一系列工作，分析了GPMVNA-1株F基因的遗4结果表明:GPMVNA-1株的F墓因全长1662bp，编码553个氛基酸，与其它GPMV毒株同A与已发表的GPMV核普酸、氮基酸同源性分别平均为97.76%,98.0，而与国家标准株F48E9和LaSota传统弱毒株的同源性分别为87.
3、4%,92.2%,84.8%,89.0%，说明GPMVNA-1株F墓因具有较高的遗传德定性，但与鸡源NDV之间发生了一定的变异;结合亲水性、表面极性、抗原位点分析不同来源的NDVF基因，为研究NDV跨种间传播提供了一定的理论基础，同时为构建基因工程疫苗英定了基础.关键词:鹅副粘病毒;F基因;遗传变异;原核表达载体自1997年以来，我国江苏、浙江、上海、广东、广西、山东、湖南、吉林、内蒙古等很多省市鹅群不断爆发一种急性高度致死性传染病，给养鹅业带来巨大的经济损失。经鉴定病原为基因VII型新城疫病毒(N
4、DV)，打破了“水禽不感染新城疫或感染不发病”的传统理论。2004,2005年又在我国福建番鸭、猪体内分离到NDV弱毒株。新城疫(Newcastledisease,ND)感染谱扩大的趋势，给人类敲响了警钟。NDV属副粘病毒科成员，为单股负链分节段RNA病毒，基因组全长达15192bp，共编码6种蛋白【1]，核衣壳蛋白(NP)、蛋白(P),基质蛋白(M)，融合蛋白(F)、血凝素一神经氨酸酶(HN)以及大蛋白(L)。其中F蛋白对NDV的毒力及感染性起决定性作用【2-4]，同时F蛋白是NDV的主要免疫原性
5、蛋白【5],F基因具有较高的遗传稳定性，是NDV基因分型的主要依据，因此是研究基因工程疫苗的首选目的基因。本研究通过对鹅源副粘病毒NA-1株F基因的测序、同原性分析、抗原位点分析等，研究F基因的遗传变异情况，从而便于下一步更深入地研究新城疫病毒跨种间传播的分子生物学机制。同时构建了原核表达载体，为研制基因工程疫苗奠定了基础。1材料与方法1.1病毒鹅副粘病毒NA-1株为本研究室分离保存。1.2菌种和载体工程菌DH5a由本研究室保存，克隆载体pGEM.-T为Promega公司产品，表达载体PET28a为
6、Novagen公司产品。1.3酶与试剂DNAMarkers.LATaq酶、限制性核酸内切酶(EcoRI,SalI)，购自TaKaRa公司;DNAgelextractionKit购自vitagene公司。1.4病毒的增殖GPMVNA-1株经适当稀释后，绒毛尿囊腔接种于9-11日龄SPF鸡胚，收集24^-48h433·言谁传雏偏死亡鸡胚尿囊液，-20℃保存。1.5PCR引物的设计与合成参考GeneBank收录的GPMV核昔酸序列，设计了1对用以扩增GPMVNA-1株F基因的引物，上游引物序列P1为:5'
7、-TTAGAATTCATGCGCTCCAAACCTTCT-3';下游引物P2为:5'-AATGTCGACTGCTCTTGTAGTGGCTC-3'，两引物5'端分别加上了EcoRI和SalI酶切位点。1.6GPMVRNA的提取按常规方法[61进行1.7RTPCRRT反应体系:RNA10n1,RudomPrimer(IOpmal/g1)2p.1,AMV(IOU/111)2闪，AMVRt5xBufer6n1,dNTP(2.5mmol/Lo4ch)411,RNaseInhibitor(40U/pl)lnl,
8、DEPC处理水5p1.RT反映条件:25C10min,42090min,99CSruin,40CSmin.PCR反应体系:IOxLA伽buffer5川,ONTP(2.5mmol/l-#ach)4川，上下游引物各lOpmol,cDNA5[.1,LATaqlU/p.l，加ddH2Q至5041.PCR反应条件:951C预变性Smin-"94℃变性45S--+560C退火505-720C延伸2min，共进行30个循环后，721C延伸lomin。取1OgjPCR产物，进行1%琼
