高效液相色谱方法的建立

《高效液相色谱方法的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、高效液相色谱高效液相色谱方方法的建立法的建立•步骤•样品制备•分离模式的选择•色谱柱的选择•流动相的选择•洗脱方式的优化•检测方式的选择色谱理论简单色谱理论简单回顾回顾'•分离和保留:保留因子'=tR-1，分离因子（选择性）a=k2ktk1'0B•谱带展宽:H=A++Csu+Cmuu2222•柱外效应:sext=sinj+sdet+stube•分离度：2(tR2-tR1)，R=næk'öæa-1öR=ç÷ç÷W1+W24èk'+1øèaøW0.05h•峰对称性：拖尾因子Tf=，2d1æaö对称因子symmetry=ç÷è

2、bø0.1hfAsCs•校正因子:=ARCRHHPPLCLC方法建方法建立立的步骤的步骤•收集样品信息，明确分析的目的和要求•选择样品制备方法•确定检测方法和条件•确定HPLC分析模式，选择相应色谱柱•优化分离条件•定性、定量分析•方法验证样品信息样品信息样品中的化学成分，及各成分的含量范围化合物的结构或官能团化合物的分子量化合物的酸碱性和pKa、pKb值适宜的样品溶剂及溶解度化合物的紫外吸收光谱分析目的和要求分析目的和要求•准确度•精密度•分离度•灵敏度•主成分的定性、定量•分析速度•杂质分析，如有关物质及降解产物等•

3、药物代谢动力学或药物代谢物研究•中药有效成分或指标成分的定性、定量•中药指纹图谱分析•合成聚合物或生物大分子的分子量及其分布或序列分析样品样品处处理理根据实验目的，目标分析物，检测要求等选择适当的样品处理方法•溶解、稀释、过滤•超声萃取•溶剂萃取•固相萃取•多种方式联合使用•柱前衍生，柱后衍生注意：供试品溶剂与色谱条件的匹配HHPPLCLC模式的模式的选择选择硅胶的正相色谱溶于正己烷用键合相的正相色谱溶于甲醇或甲醇/水溶于有机溶剂用键合相的反相色谱或乙腈或乙腈/水用键合相的反相色谱分子量<2,000溶于四氢呋喃低分子凝胶

4、渗透色谱用键合相的反相色谱溶于水非离子化抑制电离反相键合相色谱样品离子对键合相的反相色谱离子化用硅胶的正相色谱离子交换色谱溶于有机溶剂凝胶渗透色谱分子量>2,000凝胶过滤色谱溶于水大孔填料的离子交换色谱用大孔填料的反相色谱HHPPLCLC分离模分离模式式及应及应用用范围范围方法流动相色谱柱应用范围反相HPLC水-有机溶剂C18，C8，苯基，能溶于水-有机混合溶液的中氰基性或弱酸、弱碱性化合物离子对HPLC水-有机溶剂，缓冲溶液C18，C8酸碱性化合物或离子化合物和离子对试剂正相HPLC有机溶剂的混合溶剂氰基，氨基，二醇

5、难溶或不溶于水-有机混合溶基，硅胶液的化合物，异构体（立体，位置）分离以硅胶更好离子交换色谱缓冲溶液阴离子交换或阳离蛋白，多肽，核酸；无机离子子交换分离应首选离子色谱分子（尺寸）排水相（GFC）；纯有机GFC:二醇基；大分子化合物，蛋白质或聚合阻色谱溶剂（GPC）GPC:聚苯乙烯或物等硅胶亲和色谱缓冲溶液亲和配基，非成键生物大分子作用力，分子识别疏水-相互作用缓冲溶液类似反相填料，但水溶性蛋白质，疏水性随盐浓色谱疏水性小得多度而改变手性色谱水-有机溶剂各种手性填料光学异构体（对映体）选择色谱柱选择色谱柱1.根据样品特性选

6、择分离模式2.根据色谱柱性能3.根据分离规模来选择4.柱硬件状态色谱柱的选择色谱柱的选择反相硅胶键合色谱柱性能参数硅胶类型不定形硅胶，球形硅胶柱容量，充填均匀度硅胶纯度金属含量，填料酸性峰形颗粒类型全多孔微粒，微表膜颗粒，灌流颗粒不同的传质阻力，分离速度，柱容量填料粒径粒径大小分布，均匀度充填均匀度，流速相关性填料孔径7～12nm，30nm适用的化合物分子量范围键合密度含碳量容量因子，保留时间键合方式键合相修饰选择性，水性流动相的耐受性比表面积保留位点的多少柱容量柱填料量柱床实密性柱容量封端技术屏蔽硅醇基，消除二次化学平

7、衡作用碱性化合物的峰形，选择性pH，温度适用范围pH2~8(3~6),pH1~11；40~80°C色谱柱使用寿命流动相的选择流动相的选择反相色谱•有机溶剂：甲醇，乙腈，四氢呋喃，异丙醇等•酸：磷酸，乙酸，甲酸，三氟乙酸等•碱：三乙胺，稀氨水（注意色谱柱的耐受性）等•离子对试剂：烷基磺酸钠，氢氧化四丁基铵等•缓冲盐：磷酸盐，醋酸盐，枸橼酸盐等中性化合物中性化合物1.首先以水-有机溶剂进行二元分离；首次实验采用强溶剂，随后逐渐降低有机相比例经验规律：有机相降低10%，k’增加约3倍2.采用梯度洗脱方式，优化流动相组成调节有机

8、相的比例改善分离中性化合物中性化合物溶剂强度及溶剂优化酸、碱及离子酸、碱及离子化化合物合物1.酸碱平衡与保留缓冲对适用的pH范围甲酸及其盐pH3~4乙酸及其盐pH4~5磷酸及其盐pH2~7缓冲盐浓度：10~50mmol/L+HAH+A++B+HBH酸、碱及离子酸、碱及离子化化合物合物2.离子对色谱法离子对试剂C/C