质粒DNA的提取酶切及浓度检测

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1、实验5质粒DNA的提取质粒的概念质粒：质粒是细菌染色体外的遗传物质，大小在1~200kb之间，大多是具有双股闭合环状结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于细胞浆中。质粒提取目的PCR的模板质粒作为克隆载体(研究目的基因时，常需要提取质粒)质粒提取的方法与原理碱裂解法SDS裂解法煮沸裂解法氯化铯-溴化乙锭梯度离心法试剂盒法碱裂解法溶液150mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mMTris-HClpH8.0。溶液20.2mol/LNaOH,1%SDS溶液3乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)：60mL的5mol/

2、LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2O培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时;取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1充分混匀放置3-5分钟;加入200l新配制的0.2mol/LNaOH+1％SDS（变性液），加盖颠倒3-5次使之混匀，冰上放置5min;质粒小量提取的方法（手工提取）：加入150l乙酸钾溶液(溶液III)，加盖后颠倒3-5次混匀，冰上放置5min;用台

3、式高速离心机，12000r/min离心15min，上清移入另一干净离心管，并加2倍100％乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;沉淀用0.5ml70％乙醇清洗一次，12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;加入30-50l含有20g/mlRNase的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。注意：用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II

4、和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！质粒小抽试剂盒原理：把硅胶薄膜的优点与经典的碱-SDS裂解细菌细胞法结合起来。优点：操作简便、节约时间、性/价比高。使用者需备10,000xg以上高速离心机1.5ml的灭菌干净小离心管灭菌去离子水(或TE缓冲液)无水乙醇注意一、使用前往准备好的SolutionI中加入RNaseA，二、浓缩的WashBuffer需用乙醇稀释：三、稀释后的DNAWashBuffer需室温保存；四、所有步骤必须在室温下操作。实验操作步骤增殖细菌、扩增质粒裂解菌体

5、、获取质粒抽提质粒、分离纯化结果鉴定对于未经酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带1）（松弛）螺旋状质粒DNA带2）超螺旋状质粒DNA的带以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。质粒DNA提取范例：质粒DNA的酶切鉴定1.实验目的和要求学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。2.相关基础知识限制性核酸内

6、切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。1)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ型Ⅱ型*Ⅲ型II型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具

7、酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5’……GAA

8、TT_C……3’3’……C_TT

9、AAG……5’垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和‘表示在双链上交错切

10、割的位置II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是：5’……GAT’

11、ATC……3’3’……CTA’

12、TAG……5’这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端：2)影响核酸限制性内切酶活性的因素(1)DNA的纯度；(2)DNA的甲基化程度；(3)酶切消化反应的温度