蔬菜内生放线菌的分离

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1、第二章蔬菜内生放线菌的分离23第二章蔬菜内生放线菌的分离第一节表面消毒和表面消毒检验方法的研究为了保证分离的是植物内部微生物减少植物表面微生物的干扰本节对植物材料的表面消毒和表面消毒检查进行了比较和研究1.1材料1.1.1供试蔬菜大连旅顺蔬菜保护地茄子采集后立即使用1.1.2分离培养基YCED培养基初筛培养基抑制剂浓度为每L培养基中含有250U的链霉素和50mg的重铬酸钾培养基配法参见附录1.1.3研磨缓冲液PBS缓冲液配法参见附录1.2方法1.2.1植物材料的清洗洗净供试材料的浮土用洗涤剂浸泡30mi

2、n流水冲洗30min用滤纸吸干表面的水分1.2.2材料的表面消毒对茄子的根茎叶各部分分别用下面的方法表面消毒1用75%乙醇浸泡3min然后用12%NaClO中浸泡15min无菌水磁力搅[1]拌下浸洗5次每次5min2用75%乙醇浸泡3min然后用0.1%HgCl2中浸泡15min无菌水磁力搅拌下浸洗5次每次5min蔬菜内生放线菌的分离和生物活性初探241.2.3表面消毒的检验1无菌水检验法取最后一次清洗后的无菌水200L涂布于各分离培养基培养皿上28下培养36天2组织印记法表面消毒后的材料取少许的组织块

3、直接放到分离培养基培养皿上28下培养36天1.2.4分离培养1表面消毒后的各个植物组织部位无菌条件下用PBS缓冲液研磨研磨液8层无菌纱布过滤后取200L直接涂布于各分离培养基培养皿上28下培养36天2表面消毒后的植物根和茎部组织块用无菌手术刀切割产生创伤面将创伤面紧贴分离培养基培养皿上28下培养36天1.3结果和讨论1.3.1两种表面消毒剂和两种表面消毒检验方法的比较结果表2-1和表22分别列出了茄子不同组织部位消毒检验培养时菌落出现的数量和时间由表中数据可见使用两种表面消毒剂消毒后表面消毒检验培养皿中

4、出现的菌落数量极少说明植物表面微生物对分离培养过程的干扰小分离培养皿中的菌落绝大部分应为内生微生物只要对于少数表面消毒检验培养皿中出现的菌落给予排除就可以保证所分离的菌落为植物内生菌表面消毒剂的评价标准为表面消毒检验培养皿中出现的菌落数量越少菌落出现的时间越晚说明该表面消毒剂的消毒效果越好表面消毒检验方法的评价标准为表面消毒检验培养皿中菌落数量越多菌落出现的时间越早说明该表面消毒检验方法的灵敏度越高在消毒检验培养中使用0.1HgCl2消毒比使用12NaClO消毒出现的菌落数量少出现时间晚所以0.1HgC

5、l2的消毒效果好于12NaClO鉴于第二章蔬菜内生放线菌的分离25升汞的消毒能力本来就强与次氯酸钠该结果很易理解比较无菌水检验和组织印记检验这两种表面消毒检验方法组织印记法比无菌水检验法菌落的数量多出现的时间早说明用组织印记法检验表面消毒更为灵敏可能是因为消毒后的组织块和培养基有较长的接触时间较大的接触面积如果消毒不彻底组织块表面的菌含量会远高于洗涤水中的菌含量在表面消毒检验过程中检验所用的组织块存在裸露的切口长时间培养时组织液会渗出这时出现的菌落实际上已是内生菌落影响对检验结果的正确判断所以使用组织印

6、记法检测表面消毒效果时培养时间最好不要持续太长根据上述实验结果和讨论在内生菌的实际分离过程中采用的表面消毒检验方法为将表面消毒后的组织块在培养基表面滚动并轻轻印记取出组织块后用玻璃涂棒涂布均匀在培养箱内培养表2-1不同表面消毒剂和表面消毒检测方法中出现的菌落数量根部茎部叶部NaClOHgCl2NaClOHgCl2NaClOHgCl2YCED无菌水无无无无无无培养基组织印记无无221无初筛无菌水1无1无1无培养基组织印记112141表2-2不同表面消毒剂和表面消毒检测方法中菌落出现的时间天根部茎部叶部Na

7、ClOHgCl2NaClOHgCl2NaClOHgCl2YCED无菌水无无无无无无培养基组织印记无无33636无初筛无菌水10无10无27无培养基组织印记52735320蔬菜内生放线菌的分离和生物活性初探263.2表面消毒方法对内生菌的分离的影响表2-3不同表面消毒剂消毒后分离的菌株数培养基根部研磨根部组织块茎部研磨茎部组织块叶部研磨NaClOHgCl2NaClOHgCl2NaClOHgCl2NaClOHgCl2NaClOHgCl2YCED1011002400初筛6141663331植物材料消毒的力度包

8、括消毒剂的杀菌力使用浓度消毒时间等越大灭菌就越彻底但是消毒剂对植物组织细胞都是有毒的消毒能力越强对组织细胞的损伤也就越重这会改变植物内部的生态系统从而影响随后的内生菌分离表23比较了两种表面消毒方法的分离效果分别使用两种表面消毒剂消毒后除了茎部分离的菌株数相差不多外根和叶部次氯酸钠消毒后分离的菌株数多于升汞消毒后分离的菌株数因为升汞是剧毒药品数量有限在随后的内生菌的分离实验中多数情况下用升汞做消毒剂其它情况下采用提高次氯酸钠浓度到20减少消