研究生分子医学技能实验四

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1、生化与分子生物学技术中山医学院生物化学与分子生物学教研室实验七：乙肝病毒PCR及电泳检测实验分组，认清试剂（每组做一阳性管，其它人做患者血清）患者血清40l+40lDNA提取液，混匀沸水浴10min，10000rpm×5min（离心机的使用）取上清2l（或阳性血清2l）加入一PCR反应管6000rpm×5s，混匀一、实验操作及注意事项93℃×3min预变性(HemaPCR仪的使用与程序设计)93℃×45s，55℃×35s，72℃×60s重复25个循环72℃保温5min，-20℃保存备用琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、1%倒胶3mm、凝固后拔梳）倒缓冲液，加样电泳（

2、方向、电压、时间）染色与检测（EB10min，紫外检测）此步注意事项：1.每次加样要换Tip头，以防试剂的互相污染，尤其不要污染DNA聚合酶。2.按顺序加样。3.加样一定要准确，正确使用微量移液器是关键。4.加完试剂后将PCR反应管弹匀，离心将液体汇集管底。5.对没有热敏盖的PCR仪要加封石蜡油。二、PCR基本原理及相关知识概念聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外扩增特异DNA片断的技术,能在短时间内获得数百万个特异DNA序列的拷贝。KaryMullisPCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室KaryMullis及同事于1985年

3、发现并研制成功的。KaryMullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。相对DNA克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；广泛的应用于医学诊断、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。PCR扩增DNA片段的原理PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步：变性：加热，模板DNA形成两条单链退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，引物3'-端向前延伸，合成与模板配对的新链上述三步为一个循环，经过一个循环

4、DNA量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后目的DNA就可以扩增106~109倍。通过循环可以提高PCR的特异性。PCR反应体系的组成及功能PCR的完成是在一个0.5ml的EP管中完成，一个完整的PCR反应体系应包括以下成分：引物：是预扩增DNA片段两端的已知序列，是保证PCR特异性的关键因素，合理正确的引物设计可以提高扩增的效率与特异性。终浓度为0.1~0.5umol/L；浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。TaqDNA聚合酶有良好的热稳

5、定性，具有5‘-3’聚合酶活性，但无3’→5’外切核酸酶校正活性，无法校正DNA合成过程中产生的错配。其活性对Mg2+浓度非常敏感终浓度一般为：2.5u/100ul模板DNA相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对DNA模板纯度的要求并不严格。单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。当使用高分子量的DNA（如基因组DNA）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。模板用量也是很低的，一般认为102~10

6、4拷贝模板就可以满足要求。dNTP：已有商品化的混合液，终浓度一般为20~200umol/L。在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。10×PCR反应buffer：已作成商品化的产品，它包括：250~500mmol/LKCl；100~500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；15~20mmol/LMgCl2（对T

7、aq酶的活性影响很大，一般浓度为1.5~2.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整。）；0.1%明胶或牛血清白蛋白ddH2O调节反应体积液体石蜡油影响PCR的主要因素①PCR反应体系的各个组分②PCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）③PCR循环的次数和平台效应④操作环境平台效应及其原因三、结果分析与问题讨论谢谢！