DNA芯片的制备详细步骤

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1、第一部分：基片的制备第二部分：点样第三部分：杂交第四部分：显色系统与信号检测第一部分：基片的制备基片是生物芯片的基础，是生化反应的载体。生物芯片以其基片的不同可以分为无机基片和有机合成物基片。前者主要包括玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠，其上的探针主要以原位聚合的方法合成；后者主要有特定孔径硝酸纤维膜、尼龙膜和凝胶块等，其上的探针主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到基片上去(20-22)。在选择固相载体时，应考虑其荧光背景的大小、化学稳定性、结构复杂性、介质对化学修饰作用的反应、介质表面积及其承载能力以及非特异吸附的程度等因素。因此制作生物芯片

2、的载体材料必须以下特征：良好的生物兼容性；足够的稳定性，能够抵抗一定热、酸、碱等条件；表面活性，表面应具有各种活性基团，以便与各种生物分子连接；良好的光学性质。基片在使用前一般需活化处理。活化试剂EDC、NHS等通过化学反应在载体表面键合上活性基团如氨基、环氧化物、巯基、醛基、肼基，以便于与配基相结合，形成具有生物特异性的亲和载体，用于固定生物活性分子，如蛋白质、核酸、多肽等。不同的载体就有不同的活化方式，玻璃基片常采用氨基、醛基、巯基这三种修饰方式。主要材料：玻璃片：普通无色玻璃，规格75×25×1mm质量要求：主要设备仪器：通风厨一个、烘箱一台氨基修饰基

3、片的处理流程：1）玻片的清洗：取普通载玻片放入95%的浓硫酸与5%重铬酸钾的溶液中浸泡过夜。用蒸馏水洗净玻片，浸入25%的氨水中，过夜。取出玻片，超纯水洗净，晾干。2）玻片的硅烷化：将清洗后的玻片放入10mM氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilaneAPES)的无水乙醇溶液浸泡30分钟。用无水乙醇反复清洗几次，晾干后放入烘箱（100-110℃）烘干。1）氨基表面的活化：(1)酰化反应：硅烷化的玻片浸于lmmol二异丙基乙胺和1mmol丙烯酰氯的无水二氯乙烷溶液中摇晃反应2h，随后用二氯乙烷清洗，烘干。(2)氨化反应：1mm

4、ol氨化反应液的配制：0.67ml的四乙基五胺、0.65ml1.4-对-(3-氨丙氧基)-丁烷、0.56ml4-氨甲基-1,8-辛二胺、0.66ml4.7.10-三氧-三二唑啉硫酮二胺、0.52mlN,N-二甲基-1,6-已二胺、0.30ml2-(2-氨乙氧基)乙醇、0。02lml氨基-1,2-丙二醇和0.73mlJefamine八种氨基化合物溶解于l00ml无水的二甲基甲酰胺(DMF)中，将酰化好的玻片置于氨化反应溶液中过夜，反应时摇晃，然后玻片依次用DMF、甲醇和丙酮清洗，烘干。以上两个反应可以重复．直至所需的连接分子衍生在玻片表面。(3)表面活化：将上

5、述氨化液处理的玻片用次亚苯基二异硫氰酸盐溶液（phenylenediisothiocyanate，PDITC)活化2h，192mgPDITC溶于40ml含l0％无水吡啶的DMF中，然后用DMF，二氯乙烷清洗．干燥。4）暗盒备用保存醛基修饰芯片的处理流程：1）玻片的清洗：取普通载玻片放入95%的浓硫酸与5%重铬酸钾的溶液中浸泡过夜。用蒸馏水洗净玻片，浸入25%的氨水中，过夜。取出玻片，超纯水洗净，晾干。2）玻片的硅烷化：将清洗后的玻片放入10mM氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilaneAPES)的无水乙醇溶液浸泡30分钟。

6、用无水乙醇反复清洗几次，晾干后放入烘箱（100-110℃）烘干。3）玻片的醛基化修饰：将硅烷化的玻片放入10mM对苯二甲醛的丙酮溶液中浸泡30分钟。取出，用超纯水清洗几次、晾干。注：此处参考<<一种醛基修饰的基因芯片基片及其制备方法>>。百傲目前使用的此方法。或：将硅烷化的玻片放入5%戊二醛的丙酮溶液中浸泡30分钟。取出，用超纯水清洗几次、晾干。3）暗盒备用保存。巯基修饰芯片的处理流程1）玻片的清洗：取普通载玻片放入95%的浓硫酸与5%重铬酸钾的溶液中浸泡过夜。用蒸馏水洗净玻片，浸入25%的氨水中，过夜。取出玻片，超纯水洗净，晾干。2）巯基化修饰：取玻片无水

7、乙醇冲洗后浸入MEA（1%3-巯基丙基三甲氧基硅烷，95%乙醇，16mM乙酸）溶液中1个小时，再于95%乙醇与16mM乙酸(pH4.5)溶液中浸泡5分钟，迅速放入干燥的氮气中室温过夜。第二部分：芯片的点样主要设备仪器：点样仪一台1．点样的基本要求：片基大小：标准载玻片25mmX76mm点样面积：最大22mmX73mm点样方式：接触式（针式）或非接触式（喷式）样点大小：75~300微米（直径）样点间距离：100~300微米点样密度：1000~10000点/平方厘米点样精度：CV5~10%点样速度：5~20片/分钟定位精度：±10um2．点样的流程：1）点样液的

8、配置：点样液常用的有三种：50%DMSO或3XSSC