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《银染聚丙烯酰胺检测牙鲆微卫星DNA实验方法的分析探讨》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、银染聚丙烯酰胺检测牙鲆微卫星DNA实验方法的分析探讨杜爽杨磊仇雪梅摘要：为了筛选和检测牙鲆种群中具有较好表现的微卫星多态性,对聚丙烯酰胺凝胶及银染方法进行了选择。经过反复的实验，总结出了一套适用于牙鲆微卫星检测的方法。该方法具有灵敏度高、背景浅、污染小、条带清晰等突出特点,能有效地控制染色背景,显著提高检测分辨率,整个染色过程所需时间短,具有广泛的推广价值。关键词:银染;微卫星;聚丙烯酰胺凝胶 微卫星DNA(microsatellite)又称简单序列重复(SampleSequenceRepeats,SSR)，一般以1～6个碱基为核心序列，经过多次的串联重复组成的长达几十个核苷酸的
2、序列[1]。与其它分子标记相比，微卫星标记具有的优点:微卫星标记具有座位数目巨大并随机分布于基因组中(内含子、外显子、基因间序列)、多态性丰富、共显性遗传方式、分析方法简单、重复性好和近缘种中引物通用性高等优点,在动物的群体遗传分析、亲子鉴定、基因组作图和遗传育种中得到了广泛的应用[2][3]。微卫星PCR产物的检测方法主要有荧光标记引物的测序法,同位素标记引物的聚丙烯酰胺电泳法,以及银染变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶方法。目前很多国内外的实验室都是通过PAGE-银染的方法来鉴定微卫星产物。在鱼类微卫星PCR产物的鉴定中，变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶方法都有所报道[4][5]。本次实验
3、，我们在应用微卫星标记对牙鲆群体的检测工作中,对银染聚丙烯胺凝胶电泳技术的最适条件进行了探索,经过多次实验,最终研究找到了其最适条件，可以对牙鲆微卫星DNA扩增产物进行更为准确、可靠的鉴定分析。1.材料和方法1.1材料1.1.1样本大连海域牙鲆群体30尾,取其肌肉加入70%乙醇后放入-20℃保存备用。1.1.2微卫星引物从NCBI上下载牙鲆微卫星序列，经过Primer5设计引物，由上海生物工程技术服务公司合成引物，并按照说明溶解引物。1.2方法1.2.1基因组DNA的提取采用文献[6]的酚、氯仿法抽提牙鲆的基因组DNA,得到的DNA加TE溶解后置-20℃冰箱中备用。1.2.2PC
4、R反应PCR反应总体积为25ul，内含100ng的模板DNA，0.4umol/L的dNTPs，1.5mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，0.25ulTapDNA聚合酶（Promega）。反应在EppendorfMastercyclerPCR扩增仪上进行。PCR反应为30个循环，每个循环包括94℃变性35s，退火30s，72℃延伸40s；首次循环前预变性5min，最后一次循环结束后72℃再延伸5min。1.2.3聚丙烯酰胺凝胶的配制1.2.3.1变性聚丙烯酰胺凝胶的配制表一不同浓度变性聚丙烯酰胺凝胶的配方药品与试剂浓度6%浓度4%尿素12.6(g)12.6(g)双蒸水14
5、.5ml16ml10×TBE1.5ml1.5ml40%丙烯酰胺溶液(38:2)4.5ml3ml10%过硫酸胺溶液200μl200μlTEMED15μl15μl总体积30ml30ml1.2.3.1非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制表二不同浓度非变性聚丙烯酰胺凝胶的配方药品与试剂浓度8%浓度10%浓度12%30%丙烯酰胺溶液(29:1)8ml10ml12ml5×TBE6ml6ml6ml双蒸水16ml14ml12ml10%过硫酸胺溶液200μl200μl200μlTEMED15μl15μl15μl总体积30ml30ml30ml1.2.4银染液的配制固定液:10%的乙醇溶液染色液:0.1%AgN
6、O3溶液和0.2%AgNO3溶液,对比效果显色液:为对比效果,采用两种显色液配方第一种配方:2gNaOH,0.1gNa2CO3,加双蒸水到250ml,在加入800μl甲醛[7]第二种配方:30gNa2CO3、1.5mL37%甲醛、0.2mLNa2S2O3(10mg/mL),加双蒸水至1000mL[8]1.2.5银染法的操作步骤固定10min→水洗2次(每次30秒)→染色15min→水洗3次(每次不超过30s)→显色(条带清晰即可)→终止。2.结果2.1非变性胶与变性PAGE胶的对比在凝胶电泳鉴定微卫星产物的过程中,变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶法都有使用。虽然两种PAGE胶检测基因型
7、结果完全一致,但有实验表明，两种PAGE胶在条带分离效果上略有区别[9]。本次实验对这两种PAGE胶做了选择比较，结果如图一、二M1234非特异性带非特异性带目标带图一10%非变性PAGE胶M1234非特异性带非特异性带目标带图二6%变性PAGE胶从图中可以看出，非变性PAGE胶和变性PAGE胶都能清楚的显示目标带，且基因型相同。但是非变性PAGE胶带型要比变性PAGE胶好，更清楚。而且变性PAGE胶制胶过程比非变性PAGE胶复杂，操作繁琐。2.2不同浓度的非变性PAGE胶的对比
