《亲和层析》PPT课件

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1、第五章亲和层析分离技术AffinityChromatography第一节　亲和层析概述亲和层析:利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术历史1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的实例。但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。20世纪60年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层析技术得到了快速的发展。生物大分子的分离优点：1.纯化过程简单、迅速2.分离效率高3.实验条件

2、温和缺点：1.亲和吸附剂通用性较差。针对某一分离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的实验条件2.配体的选择及其与基质的共价结合需要烦琐的操作步骤第二节　亲和层析基本原理及理论基础原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。亲和力生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑制剂、激素－受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。固相化(Immobilise)配体Ligand:亲和层析中能被

3、某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。即被固定在基质上的分子称为配体。基质Matrix(载体):亲和层析中与配体共价结合,使其固相化的物质。吸附(Adsorption)解吸(Elution)一、亲和层析基本原理基本原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。含配体溶液收集目的蛋白洗下未结合的蛋白混合蛋白样品平衡液带有配体的树脂珠（或胶粒）分离过程将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体

4、发生特异性的结合（静电引力、范德华力以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上），从而留在固定相上而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液（改变起始液缓冲液的pH或增加离子强度或加入抑制剂等因子）将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质二、亲和层析的特点分辨率很高分离速度快操作简便对设备要求不高亲和吸附剂通用性较差洗脱条件较苛刻与其他层析技术比较吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是利用各种分子间的理化特性的差异，如分子的吸附性质、分子

5、大小、分子的带电性质等等进行分离。由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需要较多的操作步骤、较长的时间，而且使待分离物的回收率降低，也会影响待分离物质的活性。亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学性质－亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高，是分离生物大分子的一种理想的层析方法。三、亲和层析的类型生物亲和层析免疫亲和层析固定化金属离子亲和层析拟生物亲和层析生物亲和层析利用自然界中存在

6、的生物特异性相互作用物质对的亲和层析。通常具有高的选择性。典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素-受体等。免疫亲和层析免疫亲和层析是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。例如1：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。例如2：在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分

7、离纯化。固定化金属离子亲和层析1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯合亲和层析(ImmobilizedMetal-ChelatedAffinityChromatography)”的概念，首次成功地在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与金属离子如Cu++螯合后，可与生物分子如蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从而将蛋白质分离。固定化金属离子亲和层析固定金属离子亲和吸附剂（IMA）由载体，螯合基和金属离子三部分组成，利用材料上固定的金属离子与蛋白表面的组氨酸等残基配位结

8、合，选择性的吸附蛋白质。目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合，这是IMAC用于蛋白质分离纯化的根据。金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量的这些基团的蛋白质可以通过金属离子亲和层析得到分离。拟生物亲和层析定义：是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位。以人工