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1、添加中药的鸡腿蘑发酵液对a一葡萄糖普酶及非酶糖基化的抑制作用摘要:在鸡腿蘑发酵培养基中添加不同中药进行液体培养,比较对a一葡萄糖昔酶及非酶糖基化的抑制率。结果表明,添加苦瓜的鸡腿蘑发酵液的抑制率最高,分别为(416士1.1)%和(97.0士0.3)%。以四氧啼咙诱发的糖尿病小鼠模型进行降血糖试验,结果表明添加苦瓜的鸡腿蘑发酵液有显著降血糖作用。关键词:鸡腿蘑;a一葡萄糖普酶;非酶糖基化;发酵a一葡萄糖普酶抑制剂(a一glueosidaseinhibitor)通过抑制小肠刷状缘上a一葡萄糖普酶的活性,调
2、节碳水化合物在肠道的吸收,达到防治餐后高血糖症的目的「‘]。a一葡萄糖昔酶抑制剂还有抗肿瘤、抗艾滋病病毒、抗鼠白血病病毒等作用卜4」,对其研究受广泛重视。蛋白质非酶糖基化(non一enzymaticglycosylation)在糖尿病血管并发症的发生中有重要作用。蛋白质与葡萄糖发生非酶糖基化反应,形成不可逆的糖基化终产物(advancedglyeosylationendproduets,AoES)[’〕。该反应的产生与加速将导致胶原蛋白交联祸合、心室隔膜增厚及动脉硬化,从而引起一系列生理病理改变[6j
3、。因此,减少AGEs形成也是近年糖尿病研究的热点之一。鸡腿蘑(e即rinuseomatus),又名鸡腿菇、毛头鬼伞。研究表明,鸡腿蘑具有防止肝损伤、抗肿瘤、提高机体免疫力、降血糖等功效[7一9」。近年有学者提出中药发酵技术「‘。气而鸡腿蘑作为药用真菌,也可以液体发酵生产。因此可尝试在深层发酵培养基中添加适量中药,设想鸡腿蘑在代谢过程中对中药成分进行转化,而中药成分也促进鸡腿蘑的生长与活性物质产生,从而增强治疗糖尿病的功效。本研究根据中药降血糖活性成分的差异汇‘’〕,选择低毒性、药食两用的代表性中药进行
4、试验,考察了添加中药的鸡腿蘑发酵液对a一葡萄糖普酶及体外非酶糖基化的抑制作用,并进行了小鼠的降血糖试验。收稿日期:2005一04一18作者简介:王锋(1979),男,硕士研究生,专业方向:发酵工程。Tel:0510一5864675E一mail:wxqdwf@hotmail.eom1仪器与材料1.1菌种与材料650一60型荧光分光光度计旧立公司)。鸡腿蘑菌种由本实验室筛选保藏。绞股蓝、苦荞、魔芋、百合、人参、丹参(均购自江苏无锡山河药业集团)和苦瓜(新鲜苦瓜切片后60℃烘干至恒重)粉碎后备用。a-葡萄糖
5、昔酶(无锡杰育斜酶制剂公司,效价1xl了1的刀i头4一硝基酚一a一D一毗喃葡萄糖昔(PNPG,EMerk公司);二甲双呱片(深圳中联制药厂,规格25omg);牛血清白蛋白(BSA,中国医药集团上海化学试剂公司);其余试剂均为分析纯。昆明种小鼠(雄性,体重21一269,中国科学院上海实验动物中心)。LZ培养基料面培养基:综合PDA培养基。种子培养基/g’L一‘:葡萄糖20,玉米粉15,鼓皮5,KHZPo42,MgSO4·7H203,酵母膏2,玉米浆5。发酵基础培养基/g·L一’:葡萄糖10,玉米粉15,
6、鼓皮10,KHZPo42,Mgso4·7H203。2方法与结果2.1溶液的配制中药发酵液:绞股蓝、苦荞、魔芋、百合、丹参、苦瓜的固体粉末按0.5%,人参按1.5%(w/w)分别加入装液量(发酵基础培养基)150nil的soonil摇瓶中,121℃灭菌30而n,冷却后按10%接种量接入鸡腿蘑液体种子,25oC培养4d(15Or/min)。结束后取发酵液离心(3000r/min)3Omin,以上清液作为中中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceutieals2006,37(6)·3
7、85·药发酵液。另配制未加中药的鸡腿蘑发酵液,培养方法同上。中药水提液:取等量的上述中药材固体粉末,加适量水浸泡lh后保持微沸状态煎煮30而n,离心(3000r/min)ZOmin,药汁待用,药渣中补入适量冷水再煮沸ZOmin,离心取上清液,合并药汁,浓缩至对应发酵液的体积。复配液:取上述等量的中药水提液,与等体积未加中药的鸡腿蘑发酵液混合,再浓缩至原发酵液体积。2.2抑制a一葡萄糖普酶活力试验以PNPG为底物,参考文献〔‘,‘2]测定a一葡萄糖普酶活力。用o.Zmol几、pH6.8磷酸钠缓冲液(PB
8、s)为溶剂配制lmg/mlBsA溶液,再用此BsA溶液为溶剂配制40000u力111的a一葡萄糖普酶溶液。取PBS1.7ml,上述酶液50林l,混合后37OC保温10min,再加入o.ll6mol/LpNpG溶液50林l,37oC反应10min,用o.lmol/L碳酸钠溶液10ml终止反应,于400nm处测定在酶作用下释出的对硝基酚(PNP)的吸收度。其中a一葡萄糖普酶活力单位定义为:37℃、pH6.8条件下,lmin内水解pNpG释放l卿01pNp为一
