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1、福建农林大学学报(自然科学版)第31卷第1期JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition)2002年3月PCR-SSCP分析条件的优化魏太云,林含新,谢联辉(福建农林大学植物病毒研究所,福建福州350002)摘要:聚合酶链式反应及单链构象多态性(PCR-SSCP)技术作为一种区分检测基因组之间微小差异的有效方法,具有快速、简便、灵敏和适用于大样品量筛选的特点.本研究从变性剂类型、电泳缓冲液的离子强度、交联度、电泳温度、甘油浓度及变性剂类型等方面对影响PCR-SSCP的电泳条件进行分析,以期对该方
2、法的应用提供参考.关键词:PCR-SSCP;条件优化中图分类号:S435文献标识码:A文章编号:1006-7817(2002)01-0022-04OptimizationoftheconditionsaffectingPCR-SSCPanalysisWEITai-yun,LINHan-xin,XIELian-hui(InstituteofPlantVirology,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)Abstract:Polymerasechainreaction-single-strandco
3、nformationpolymorphism(PCR-SSCP)techniqueisamethodfeasiblefordetectingminorsequencechangesinPCRamplifiedDNA,withitscharacterizationofrapidness,simplicity,sensitivityandapplicabilitytolarge-scalescreening.However,manyfactorscaninfluencetheresultsofSSCPanalysis,anditsopti-mizationishighlyempirical.
4、Inthispaper,wecomparedandanalyzedtheexperimentalresultsundervariouscontrolledconditionssuchastheconcentrationofcross-linker,theconcentrationofPAG,theconcentrationoftheelectrophoresisbuffer,thepresenceofglycerolingelsandtemperatureofthegelduringelectrophoresis.Resultsshowedthatitwascom-montorunthe
5、samplesunderatleasttwodifferentconditionsbecauseeachfragmentneededitsownoptimalrunningcondi-tions.Keywords:PCR-SSCP;conditionsoptimization聚合酶链式反应及单链构象多态性(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymor-phism,PCR-SSCP)技术是一种检测PCR产物微小差异的有效方法.该技术能快速检测出短片段中单个[1]碱基的变异,已应用于基因突变的鉴定、遗传病致病基因分析和基因诊断
6、,但很少应用于植物病毒学中.目前该技术仍不成熟,在所有报道中,SSCP分析所用的各种条件各不相同,且存在较大分歧,特别是在电[1]泳温度及甘油使用方面;同时,对进口的电泳装置和同位素或银染标记的依赖,限制其普遍应用.本研究拟对影响SSCP分析的各种因素进行摸索,并采用北京六一仪器厂DYY-Ⅲ型电泳槽进行操作和EB染色,使其在技术上更加完善,操作上更为简便,更适合一般实验室应用.1材料与方法1.1水稻条纹病毒(Ricestripevirus,RSV)分离物病毒分离物由本所采自云南保山(BS)、云南宜良(YL)、福建龙岩(LY)、上海嘉定(JD)、山东济宁(JN)、辽宁盘锦(PJ)及北京双桥
7、农场(SQ)等地病田,经分离纯化后保存于合系28水稻品种上.1.2病毒提纯及病毒RNA的提取[2]参照Kakutanietal的方法,并略作修改.1.3引物、反转录(reversetranscription)-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增参照文献[3].1.4SSCP分析取纯化产物7LL加12LL载样缓冲液(体积分数为95%去离子甲酰胺变性剂或碱变性剂即0.5mol收稿日期:2001-07-23基金项目:国家自然科学基金(30
