《菌种选育》PPT课件

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1、7菌种筛选方法所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的0.05％～0.2％。微生物的正突变概率极小，产量提高10％以上突变株也只有1/300。微生物的突变类型多，可分为两大类，第一类为形态突变株，包括菌落形态，菌丝形态，分生孢子形态。另一类是生化突变株，包括抗性突变型，营养缺陷型，条件致死突变型，产量突变等。因此，要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就

2、象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。在提高筛选品质方面，由于过去对菌体生理了解不够，只能随机筛选（randomselection），大量筛选无特定标记的突变株，因此筛选效率不佳；其后由菌株的生理研究，以及由实际研发的经验，发展出合理定向筛选（rationalselection）技术。菌种筛选方案在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，以多为，主使优良菌种

3、不致于漏网。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，以质和精为主，应精确测定每个菌株的生产指标。筛选方案：第三轮、第四轮…(操作同上)初筛和复筛工作可以连续进行多轮，直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选方案，不仅能以较少的工作量获得良好的效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。筛选获得的优良菌株还将进一步做工业生产试验，考察它们对工艺条件和原料等的适应性及遗传稳定性。8抗性筛选抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10–6频率的突变体存在，就容易筛选出来。抗性突变株的

4、筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。1）一次性筛选法一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。抗噬菌体菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。耐高温菌株法筛选：将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感

5、的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。2）阶梯性筛选法药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或

6、对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物来筛选，大量细胞中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。因为药物抗性常受多位点基因的控制，所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经“驯化”或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使

7、暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏。阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下。(1)梯度平板法(Gradientplate)先将10ml左右的一般固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结成斜面，然后将皿底放平，再倒入7-10ml含适当浓度的药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上层培养基越薄的部位，其药物浓度越稀，造成一由稀到浓的药物浓度渐增的梯度。再将菌液涂布在梯度平板上，药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物

8、高浓度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会形成的明显界线。梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，以提高相应代谢产物的产量。异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构类似。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变有可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合成更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实验证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性的。这样，通过梯度培养法就可以达到定向培