DB41∕T 1586-2018 饲料中志贺氏菌的检测 EMA-PCR法

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1、ICS65.120B46DB41河南省地方标准DB41/T1586—2018饲料中志贺氏菌的检测EMA-PCR法2018-04-17发布2018-07-17实施河南省地方标准公共服务平台河南省质量技术监督局发布河南省地方标准公共服务平台DB41/T1586—2018前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所、郑州中道生物技术有限公司。本标准主要起草人：高延玲、李金磊、狄元冉、董鹏、孟伟、刘素梅、曲登峰。本标准参加起草人：方忠意、刘占通、刘素梅、韩楠、张杰、巩丹、王乐、范念亭、张艳娜、

2、张崇威、王丽、孟祥。河南省地方标准公共服务平台I河南省地方标准公共服务平台DB41/T1586—2018饲料中志贺氏菌的检测EMA-PCR法1范围本标准规定了饲料中志贺氏菌的EMA-PCR检测方法。本标准适用于饲料中志贺氏菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8381.2饲料中志贺氏菌的检测方法GB/T14699.1饲料采样3原理叠氮溴化乙锭（EMA）能够透过死细菌的细

3、胞膜，在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合，使死细菌DNA不能作为模板进行PCR扩增，而活菌能进行PCR扩增。4试剂和材料4.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682一级水的要求。4.2GN增菌液：见附录A的A.1。2+4.32×PremixTaq缓冲液：内含TaqDNA聚合酶1.25U/25μL，4mmolMg，dNTP各0.4mmol。4.4特异性引物(对)序列为：a）上游引物：5＇-TTGCTGCTGATGCCACTGAGA-3＇；b）下游引物：5＇-CCAGAGGGAGAACCAGTCCTTA-3＇。4.5琼脂糖：电泳级

4、。4.6Marker2000。4.7志贺氏菌ATCC12022。4.850×TAE缓冲液：见附录A的A.2。4.96×上样缓冲液：见附录A的A.3。4.10叠氮溴化乙锭（EMA，0.2mg/mL）：见附录A的A.4。4.11溴化乙锭（10mg/mL）。4.12灭菌离心管：1.5mL，15mL。5仪器设备河南省地方标准公共服务平台1DB41/T1586—20185.1PCR仪。5.2天平：感量0.01g。5.3电热恒温培养箱。5.4离心机：转速≥12000r/min。5.5浊度仪。5.6卤素灯：照度≥25000勒克斯（Lux）。5.7核酸电泳仪。5.8凝胶成像系统

5、。5.9微量移液器：0.5μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL，1mL～10mL。5.10涡旋仪。6样品采集与制备按GB/T14699.1的规定采样，将样品充分混匀后密封低温保存，整个过程避免人为污染。7检验步骤7.1增菌取25g试样于225mLGN增菌液（4.2）中，充分混匀，36℃±1℃培养6h～8h。如果试样量不足25g，试样质量与增菌液的体积比应为1∶9。7.2模板的制备取1mL增菌液至离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。加入1mL灭菌水悬浮沉淀物，12000r/min离心2min，弃上清，重复洗涤一次。加适量灭

6、菌水悬浮沉淀物并调节菌悬液浓度至0.5麦氏单位（MCF）。取0.2mL菌悬液至离心管中，加入0.5μLEMA溶液（4.10）混匀，避光孵育5min。将离心管开盖置于冰上，卤素灯照射下曝光1min，然后水浴煮沸10min，再将离心管转移至冰浴中使其快速冷却。涡旋混匀裂解物，12000r/min离心2min，收集上清液，作为PCR扩增的模板（模板制备可选用等效的商品化试剂盒）。检测过程中分别设阳性对照和阴性对照，用添加志贺氏菌阳性标准菌株的样品作为阳性对照，用不含志贺氏菌的样品作为阴性对照。7.3PCR扩增采用50μL反应体系：2×PremixTaq缓冲液（4.3）

7、25μL，模板5μL，浓度为20μmol/L的上、下游引物各1μL，灭菌水18μL。反应程序为：95℃预变性5min；35个循环：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s；72℃终延伸5min后4℃保存。7.4电泳检测PCR扩增产物称取1.5g琼脂糖（4.5）加入100mL1×TAE电泳缓冲液（4.8）中，加热使其充分熔化，冷至65℃左右，加入5μL溴化乙锭（4.11），充分混匀，根据需要在模板内放入合适的梳子，倒入凝胶制成约5mm厚的胶块。在电泳槽中加入适量1×TAE缓冲液，使液面没过凝胶2mm左右。取PCR扩增产物5μL～8μL与1μL6×上样缓

8、冲液（4.9）混合后加入