组织石蜡切片制作

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1、组织石蜡切片制作（一）组织固定包埋切片1用途2主要设备3药品及溶液配制4具体步骤及注意事项5出现问题及解决1用途（1）用于各种组织结构分析（化学染料）H.E.染色;PAS染色；苯胺蓝染色；油红O染色；茜素红染色；等等（2）用于组织中特定蛋白质的定位表达分析免疫组化；免疫荧光（3）用于组织中特定基因mRNA的定位表达分析原位杂交；荧光原位杂交2主要设备•1瓷盘；刀片；记号笔；通风橱；•2石蜡；电炉；酒精灯；玻璃吸管；纸槽（需要提前折叠好）；大平皿；染色缸；吸水纸；镊子（至少2把）•3切片用刀片；毛笔；玻片盒；切片机；预处理的玻片；展片5

2、2度恒温水；吸水纸；铅笔；恒温箱实验前准备•思想上重视，考虑到每一步都不能出错。•时间上准备，充足的时间做实验。•技术上准备，考虑材料的特点对各个步骤的改进，生搬硬套其它组织的过程会出问题。•实验条件的准备，设备和药品，溶液配制等等是否齐备。4具体步骤及注意事项4.1取材•根据不同的目的、组织特征代表性取材。•取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5×5mm2。每个组织最好多取几块。•取材时要注明取材时间、组织器官名称、固定液名称、组织块的数量、所取组织位于器官的部位等，以备查。4.2固定固定剂的

3、作用对象主要是蛋白质（一）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林100ml;蒸馏水900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液10ml;蒸馏水90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。•3．4%多聚甲醛•先配制8%多聚甲醛:•多聚甲醛8g;蒸馏水100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。滴加1NNaOH，并不停搅动至液体清明。•再取8%多聚甲醛50ml，用0.1M磷酸二氢钠和0.1M磷酸氢二钠将P

4、H值调至7.2•PH=7.2的PBS缓冲液50ml•4．Bouin液：苦味酸饱和水溶液75ml36％~40％福尔马林液25ml冰醋酸5m15．改良Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液45ml95%酒精45ml36％~40％福尔马林液5ml冰醋酸5m1•固定时，须注意以下几点：（1）固定剂应有足够的量，一般为组织块体积的10～15倍。（2）固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到几十小时，有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强，作用时间应严加控制，不能过长。（3）一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。PAF应

5、放在4度。3．水洗•目的：洗去渗入组织中的固定液，终止固定。以免影响对组织内结构的观察、分析和研究。（1）各种以水配制的固定液如甲醛，都必须用流水冲洗，大块组织一般冲洗24小时，小块组织一般冲洗2—10小时。（2）固定液为多聚甲醛时，用于免疫组织化学等特殊染色的应将组织投入PB缓冲液中，每60分钟更新洗涤液一次，累计6小时。（3）经含有苦味酸的固定液固定的组织块，无论其固定液是水溶性还是酒精溶性，都应充分冲洗，水溶性固定液固定的组织块一般须冲洗12小时，再进入70%的酒精溶液洗涤，酒精溶性固定液固定的组织块直接进入70%的酒精溶液洗涤

6、，该溶液可以脱掉苦味酸的黄色，但最好从50%酒精开始洗涤。（4）固定液为酒精或是酒精混合液，一般不需用水冲洗，其组织块的洗涤应用与固定液浓度相等垢酒精换洗或者直接进行脱水的程序。3．脱水及透明•3.1脱水的目的组织内的水不能和支持剂混合，所以必须把组织中的水分彻底脱除。脱水有利于组织的透明和浸蜡，有利于组织的永久保存。•3.2乙醇可作固定剂，又可脱水剂，但乙醇与水混合时有较剧烈的物理反应。高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点，因此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水，而必须经过由高到低的一系列不同浓度的酒精，逐渐取代组织中水分，以保证

7、组织脱水彻底，并避免组织过度收缩和硬化。•3.3乙醇脱水过程50%乙醇6~8小时-75%乙醇6~8小时-85%乙醇3~5小时-95%乙醇1~2小时-95%乙醇1~2小时-100%乙醇Ⅰ1小时-100%乙醇Ⅱ1小时•3.4脱水注意事项：（1）脱水的过程应逐步地而不应骤然地进行，不能操之过急。（2）脱水的时间应根据组织块的大小和组织的类型而定。（3）组织块在高浓度，特别是无水乙醇内不能放置的时间太长。无水乙醇吸水能力太强，容易造成组织块的过度硬化，使得切片理组织易碎裂。（4）在脱水的过程中可以将组织块停留在70%~80%的酒精中。（5）每

8、次更换新的脱水剂时（组织块从低浓度到高浓度），都要把组织块放在吸水纸上吸干，装组织块的容器也要控干水分，以免将水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中，影响脱水效果。（6）脱水剂的先择要根据实验的要求及实验室的条件。•3.5透