霍山石斛微卫星标记的筛选及遗传多样性分析_郑基阳

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1、第36卷第21期Vol.36，Issue212011年11月November，2011·资源与鉴定·霍山石斛微卫星标记的筛选及遗传多样性分析121，311，31，3*郑基阳，陈乃富，王晖，高鹏，邵剑文，朱国萍(1.安徽师范大学分子生物学及生物技术研究所，安徽芜湖241000;2.植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，安徽六安237012;3.生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室，安徽芜湖241000)［摘要］目的:利用磁珠富集法构建霍山石斛的微卫星文库，用筛选出的微卫星引物对安徽霍山居群的24株野生霍山石斛进行遗传多样性分析。方法:根据链亲和素磁珠和生物素特异结合的特性，用3'端生

2、物素标记的探针与两端连接已知序列人工接头的霍山石斛基因组DNA酶切片段杂交，杂交复合物结合到包被有链亲和素的磁珠上，洗脱并收集吸附在磁珠上的含有微卫星的片段。经过克隆和测序，再根据微卫星两侧的保守序列设计引物，最后利用从中筛选出的微卫星引物对霍山石斛居群进行遗传学分析。结果:本实验共筛选得到12对多态性位点丰富、带型清晰、重复性好的引物，并检测到65个等位基因，每个位点的等位基因数从2到8个不等，平均预期杂合度(HE)和平均观察杂合度(HO)分别为0.638，0.500。12个多态性位点的哈温平衡检测结果显示有2个位点显著偏离哈温平衡(P＜0.05)，可能是由于存在无效等位基因。连

3、锁不平衡检测结果表明有3对位点显著连锁不平衡(P＜0.05);结论:这些微卫星标记可以用于霍山石斛的居群遗传学分析。［关键词］霍山石斛;微卫星标记;居群遗传学霍山石斛DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tanget对霍山石斛的化学成分、活性成分的药理作用进行［6-9］S.J.Cheng为兰科Orchidaceae石斛属Dendrobium了大量的研究，而有关微卫星标记用于霍山石斛珍稀濒危植物，主产于我国安徽省霍山县，是药用石居群遗传多样性的研究尚未见报道。本研究开发和［1］斛中的极品。由于霍山石斛对生长条件要求极筛选了高多态性的霍山石斛微卫星标记，并用这些为苛刻，加上

4、生境的破坏和人为过量采集，其野生植标记分析了霍山石斛居群的遗传多样性。这些标记株已濒临灭绝，现已被列入我国第二批国家I级重将为霍山石斛的分子育种、药材的真伪鉴别和种质点保护植物，同时世界自然保护联盟(IUCN)将其确纯度鉴定提供理论依据。定为极危(CR)物种，濒危灭绝野生动植物国际贸易1材料公约(CITES)也把霍山石斛列入了附录II。1.1霍山石斛选取安徽省霍山县太平畈乡霍山微卫星(microsatellite)标记，又称简单重复序列石斛种植基地24份野生霍山石斛样品为材料，经植(simplesequencerepeat，SSR)，由2～6个核苷酸的物细胞工程安徽省工程技术研究中

5、心陈乃富教授鉴重复单位组成，广泛分布于真核基因组中，具有高多定为兰科植物霍山石斛D.huoshanense。态性、呈共显性遗传以及结果稳定可靠等优点，已被1.2仪器与试药DCode通用突变检测系统、My-广泛应用于植物居群的遗传结构研究、植物保护遗TMCyclerThermalCycler，GelDoc2000凝胶成像系统［2-5］传学和植物种质资源的鉴定。目前国内外学者(美国Bio-Rad公司)。Centrifuge5415D(德国Ep-pendorf公司)。StreptavidinMagneSphere顺磁性［稿件编号］20110528001颗粒、GoTaqDNA聚合酶、D

6、NA分子质量标准25［基金项目］国家自然科学基金项目(30870062，31040003);教育bpDNAStepLadder(美国Promega公司)。T4DNA部新世纪优秀人才计划项目(NCET-06-0558)连接酶、DNA分子质量标准pUC19DNA/MspI(Hpa*［通信作者］朱国萍，教授，博士生导师，Tel:(0553)3829862，Ⅱ)Marker，23(加拿大Fermentas公司)。TaqE-mail:gpz1996@yahoo.com［作者简介］郑基阳，硕士研究生，研究方向为植物分子生物学，DNA聚合酶，限制性内切酶Sau3AI，pMD19-TE-mail

7、:jiyangaq@163.comSimpleVector(日本TaKaRa公司)。DNA相对分子·2926·第36卷第21期Vol.36，Issue212011年11月November，2011质量标准DNAMarkerII，DNAMarkerIII［天根生化的单链DNA”复合体加入到磁珠悬浮液中，摇匀后科技(北京)有限公司］。DNAGelExtractionKit(美室温放置30min。间断轻轻混匀(每5～10min)。国Axygen公司)。十六烷基三甲基溴化铵④