实验实训五精子数量计算和畸形率的测定

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1、实验实训五精子数量计算和畸形率的测定(一)实验目的1.学握测定每毫升精液中所含有精子数的方法，以及测定精子畸形率的操作耍点。2.测定每一头份冷冻精液内有效精了数，以确定是否符合输精标准要求。(二)实验材料1.材料任选一种公畜或雄性实验动物的新鲜精液及冷冻精液。2.器械显微镜、载玻片、盖玻片、红细胞及白细胞稀释管、血(色素)吸管、血细胞计算盘、光电比色计、5ml试管、1ml及2ml吸管、玻棒、染色缸、染色架、玻片锻、纱布。3.几种染色液配方(1)0.5%龙胆紫：0.5g96%酒精：100ml(2)酒精固定液:40%叩醛(福

2、尔马林)：12.5ml96%酒精：87.5ml<3)凡那他氏镀银染色液。①胡氏固定液福尔马林：2ml醋酸：1ml蒸懈水：100ml②染色液单宁酸：5g石炭酸：lg蒸傑水：100ml③硝酸银溶液硝酸银：()・25g蒸憾水:100ml(4)威廉斯染色液①品红原液、品红：10g96%酒梢：100ml②伊红原液将伊红溶丁酒精中制成饱和溶液。③染色液晶红原液：10ml5%石炭酸：100ml取混合液：50ml伊红原液：25ml注：充分混合，至少放置14d后，•经过滤可用于梢子染色。④美蓝原液美蓝：l()g酒精(96%)：100ml、

3、4.畸形精了形态图、•血细胞计算盘构造图(三)实习内容1.精子数量测定(1)血细胞计算盘测定法。①清洗器械。先将血细胞计算盘及盖玻片用蒸係水冲洗，使其自然干燥。血吸管或红细胞和白细胞稀释管先用蒸馆水冲洗，再用95%酒精清洗，最后用乙瞇清洗。试管及吸管洗净后须经烘干。②精液的稀释。用lml吸管准确吸取3%NaC10.2ml或2ml,注入小试管中。根据稀释倍数的要求,再用血吸管吸出l()t-d或2()/1INaCI溶液弃去。用血吸管或红、白细胞稀释管吸取精液至刻度1/11或20/11处。用纱布擦去吸管吸端附着的精液。将精液注

4、入到小试管屮。用拇指按住小试管口，振荡2-3min使其混合均匀。①精子的计数。将擦洗干净的计算盘置于显微载物台上，在计算室上盖上玻片。将试管屮稀釋好的精液，滴一滴于计算室上盖玻片的边缘，使精液白动渗入计算室。注意不要使梢液溢出于盖玻片之外，也不可因楮液不足而致计算室内有气泡或干燥Z处，如果出现有上述现彖应重新再作。静置3min以400—60()倍显微镜检杏。统计出计算室的四角及中央共5个中方格即80个小方格内的精了数。统计每小格内的精子，只数小格内及压在左线和上线的精子。III5个中方格(80个小方格)所统计的精子数(X

5、)代人下列公式即得出每亳升的精子数。X/8()x400x1()x稀釋倍数x1()()()=每毫升精液所含精了数确定精液稀释倍数可按表实一6、表实一7计算。表实吒精液稀释倍数精液种类稀释管种类吸取时所达到的刻度稀释倍数精液3%NaCl牛羊红细胞细管0.51101101200100血细管10/1120pl1990m1198(M200100猪马白细胞细管0.51irli2010血细管10/xl20mI190pd180pl2010表实・7精子浓度计算稀释倍数应乘常数•—稀释倍数应乘常数2001000万20100万100500万1

6、050万为了减少误差，必须进行两次精于计数，如果前后两次误差大于10%,则应作第三次检查。最后在3次检查中取两次误差不超过10%的求英平均数，即为所确定的精了数。(1)光电比色计测定法。常用的光电比色计有581・G型、72—1型和76—1型等。制备测定管，进行被检样站的比色。①牛精液精了浓度的测定。用2.9%等渗柠檬酸钠液5ml,定点到100,取鲜精0.iml加进另一个装有2.9%柠檬酸钠4.9mi的比色UlL+o如用581-G型比色计,要用42号蓝色滤光片比色;如用72-1型比色计,要用440nm进行比色，记录其透光度

7、和光密度值(X值)。同上另在测定管内加1滴8mol的苛性钠，同除去精清的密度记录其透光的光密度。②用血细胞计数盘计数，待测各鲜精样品数批，每份样品测2次，如2次谋差超过5%时所需耍重测。将2次平均值作为该透光度(或光密度)溶液的密度。用牛精液测定的结果如表实一8。衰实・8奶牛、肉牛精子密度査数表亿/ml透光率亿/ml透光率亿/ml透光率亿/ml透光率亿/ml524.76412419.72154314.6789629.6363814.5937624.49812519.45614414.4135639.3709824.328

8、3724.23332619.19074514.1481649.1055834,0629823.9679271&92534613.882765&8401843.7975923.70252818.65994713.6173668.7547853.53211023.43712918.39454813.3519678.309