鞘胺醇杆菌肝素酶的产生

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1、!"卷#期微生物学报’()*!"1(*#$%%"年&$月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$+,-,./,0$%%"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!鞘胺醇杆菌肝素酶的产生高宁国程秀兰"杨敬张树政（中国科学院微生物研究所北京&%%%5%）关键词：鞘胺醇杆菌，肝素酶，产生条件中图分类号：C72&文献标识码：D文章编号：%%%&3#$%2（$%%"）%#3%5&"3%!肝素类分子是一类结构异常复杂的高度硫酸化的糖胺聚糖，是临床上的一种主要的抗凝剂。除了抗凝血及其相关的抗栓活性以外

2、，肝素还具有多种其他生物学功能，如抗平滑肌细胞及肾小球系膜细胞［&］［$］［"］的增殖、抗炎症和阻止肿瘤生长及转移的作用等。因而肝素可用于防治球囊扩充血管成型术后的血管再狭窄、肾小球系膜细胞增生性肾炎、病理性炎症及肿瘤。但由于完整肝素的抗凝血活性，会引起出血及血小板减少综合症等负作用，限制了肝素在这些方面的临床应用。研究表明，肝素的抗凝血活性依赖于一种独特的肝素五糖序列，约占完整肝素链的&E"，除了五糖序列以外，还需要附近的至少&"［!］糖残基，因而不含五糖序列或含五糖序列小于&5糖的肝素其抗凝活性大大降低。而六糖以上的肝素片段就具有抗平滑肌细胞增生、抗炎

3、症及抗肿瘤的活性，并且这些活性与抗凝活性无关。因此，可利用特异性的肝素酶降解肝素长链，产生一系列不同结构及大小的肝素片段，并从中筛选出具有不同生物活性的片段。肝素酶是一类能降解肝素类物质的裂合酶。主要来源于肝素黄杆菌（!"#$%&#’()*+,-.)/#*+0,-）。目前已经从肝素黄杆菌中分离纯化出"种肝素酶：肝素酶!（8*4*!F$F$FA）、"（无8*4号码）和#（8*4*［7］!F$F$F5）。它们能特异性地切开肝素链上具有特定修饰的不同序列，从而产生不同的寡糖片段，分析研究这些寡糖片段将有助于了解肝素精确结构及其结构与功能之间相互关系的信息。现在，

4、肝素酶已［#］［A］［5］被用于体外循环中肝素的消除、肝素精确结构的确定、肝素抗凝机理的研究、制备低分子量肝［2，&%］［&&］［&$］［&"］素及抗肿瘤药物。另外，肝素酶本身可抑制新血管生成和血管平滑肌细胞增生，因而可能成为抗肿瘤和抗血管再狭窄的潜在药物。目前商品化的肝素酶均由肝素黄杆菌生产，价格非常昂贵。［&!］我们在继从土壤中筛选得到新的肝素酶产生菌种棒杆菌（1%*20)&#’()*+,-=G*）以后，又从土壤中筛选到一株国内外均未报道的活力更高的肝素酶产生菌鞘胺醇杆菌（3/.+04%&#’()*+,-=G*），并研究了酶的产生条件和纯化及酶的性质。

5、!材料和方法!"!菌种和培养基从土壤中筛选得到一株菌，经本所鉴定为鞘胺醇杆菌（3/.+04%&#’()*+,-=G*）。基础培养基：每升含194)&H、I$JKL!$F7H、MHNL!%F7H、肝素$H，GJ至#F7。!"#仪器和试剂O,-P.9?=@<*:.*9-*-<作者简介：高宁国（&2A&B），男，安徽省安

6、庆人，中国科学院微生物研究所2#级博士生，现在美国。收稿日期：$%%"3%&3&A，修回日期：$%%"3%53$7;14微生物学报4+卷仪。天青!，"#$%&产品；粗品肝素为南京生化制药厂产品；精品肝素为烟台生化制药厂产品。!"#培养方法和肝素酶活力测定!"#"!培养方法：将菌种从牛肉汁斜面上接入基础培养基（’(%)培养基*’((%)三角瓶），+(,-((./%#0摇床上培养123，然后按45的接种量接入装有’(%)发酵培养基的’((%)的三角瓶中，相同条件下培养+(3。!"#"$无细胞粗酶液的提取：细菌培养液1(((($离心1(%#0，用(6(-%78/

7、)磷酸缓冲液（9:26;）洗涤菌体-次，按(6-$湿菌体/%)缓冲液的比例加入(6(-%78/)的磷酸缓冲液（9:26;），在冰浴内以脉冲方式超声破碎细胞1(%#0。-(((($离心4(%#0，上清液即为无细胞粗提液。!"#"#酶活力测定：取1((!)用(6(’%78/)磷酸缓冲液（9:<6(）配制的-5肝素溶液，在+2,预热1=+%#0，加入1((!)适当稀释的酶液，准确反应13，加4%)(6(’%78/):>8终止反应。然后，采用天青!［1’］法测定!"’(’，通过标准曲线计算出被降解的肝素量。以在上述条件下，每小时降解1%$肝素所需要的酶量为一个酶活

8、力单位。!"#"%菌体生物量的测定取(61%)发酵液，加入+6?%