基因表达检测RT-PCR

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1、基因表达检测第三部分：RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)ReverseTranscriptionPCRRNA抽提cDNA反转录基因特异性引导Oligo(dT)引导随机六核苷酸引物引导PCRNorthernBlotting基因表达分析NorthernBlottingAwardedNobelPrizeforChemistryin1993.基因表达水平（梁大成等，2006）表达增强克隆的RT-PCR和Northern杂交分析ladderc1357c1357c1357c1357c1357EI12I1

2、EI22F22EI1K8EI35I3ß-actinABCDEA:IRBB10叶片接种白叶枯（PXO86）C:C101A51叶接种稻瘟病（V86013）B:IRBB13叶片接种白叶枯（PXO99）D:MH63叶片接种稻瘟病（V86013）E:MH63叶片接种稻瘟病（1366）（周斌，2001，硕士论文）mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。实验原理被污染的试剂，缓冲液移

3、液器使用的器皿及tip等操作者的手，头发等RNA操作中应注意的问题：防止RNase污染外源RNase的主要来源：当处理RNA时，移液器专用保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用；溶液和试剂分装成小份保存；RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的水冲洗）；防止外源RNase污染的主要措施(一）：准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，用0.1％的DEPC在37ºC处理溶液1小时后在15psi(1.05kg

4、/cm2高压蒸气灭菌15min。180－300ºC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品；使用新的、无RNA酶的一次性tubes,tips等；在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性。防止外源RNase污染的主要措施(二）：材料要新鲜;裂解过程要同RNase活性抑制同步防止内源RNA酶降解RNARNA酶抑制剂RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有：DEPC氧钒核糖核苷复合物RNA酶的蛋白质

5、抑制剂DEPC:是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧基甲酸化形式破坏RNase的活性OCCOO-CH2-CH3-CH2-CH3氧钒核糖核苷复合物:能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制RNA酶的活性RNA酶蛋白质抑制剂RibonucleaseInhibitor可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。RNAEXTRACTION(miniprep)RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对于Nor

6、thernblot,RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染。实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳带评价RNA质量实验材料：水稻幼嫩叶片苯酚/氯仿反复抽提，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可配合氯化铯离心或有机溶剂提取。TrizolReagent提取方法：利用Trizol试剂抽提植物总RNATrizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总

7、RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。75％乙醇（inDEPC-treatedwater)氯仿异丙醇（RNA专用）RNase-freewater：DrawwatertoRNase-freeglassbottles.Adddiethylpyrocarbonate（DEPC

8、）to0.1%.Letstandovernightandautoclave.防止外源RNase的污染：应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180ºC烘烤3hrs以上；塑料制品DEPC水清洗，蛋白质变性剂处理；一次性用品如tube,tip等使用新的，无RNA酶的产品。RNA抽提前应准备的其它试剂及物品：操作步骤（一）液氮磨样，每管分装