凝胶渗透层析法

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1、凝胶渗透层析法溴酚蓝Kav值的测定一、什么是凝胶渗透层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开来的一种层析法分子筛层析法(molecularsievechromatography)排阻层析法（exclusionchromatography）二、什么是凝胶凝胶是由一些链状有机物质单体借助共价交联剂在链间形成共价交联使之聚合而成的有机高分子聚合物，其结构为立体网状结构凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarosegel，商品名Sepharose），人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖凝胶（dextran，

2、商品名称为Sephadex）葡聚糖凝胶基本骨架是葡萄糖，葡萄糖通过1，6-糖苷键连接成链状单体，再由3-氯-1，2-环氧丙烷作为交联剂，将链状结构连接成立体网状结构孔的大小可以通过调节交联剂和葡萄糖的比例，反应条件来控制交联剂分子越多，交联度越高，网状结构中网络间孔隙的孔径越小三、原理将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使之充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶颗粒孔隙的内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，小分子则可以进入凝胶颗粒内部，流速缓慢，最后流出柱外，从而使样品中分子大

3、小不同的物质得到分离。1.概述图1凝胶层析的原理为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱，柱床体积称为“总体积”，以Vt（totalvolume）表示。实际上Vt是由V0、Vi与Vg三部分组成，即：Vt=V0+Vi+VgV0称为“孔隙体积”或“外体积”（outervolume）又称“外水体积”Vi为内体积（innervolume）又称“内水体积”Vg为凝胶本身体积2.Kd●洗脱体积（Ve，elutionvolume）与V0及Vi之间的关系可用下式表示：Ve=V0+KdViKd为样品组分在两相间的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙

4、的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关它对每一物质是常数，与柱的物理条件无关，可通过实验求得●当Kd=0时，则Ve=V0。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质（全排阻），洗脱体积等于空隙体积3.Kd值的三种情况：●当Kd=1时，Ve=V0+Vi。即小分子完全可以渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内部体积之和●当0＜Kd＜1时，Ve=V0+KdVi。即表示内部体积只有一部分可被组分利用，扩散渗透，Ve即在V0与Vi之间变化●有时Kd＞1，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve＞V0+Vi4.Kd测定Kd可通过实验求得Ve为实际测得的洗脱体积

5、Vo可以是不被凝胶滞留的大分子物质的洗脱体积,如分子量约200万的兰色葡聚糖-2000Ve－VoKd=ViVi可由干凝胶颗粒重量和吸水量求得：Vi=g·WrVe的计算:严格讲，要根据上样量决定A←Ve→0Ve上样体积小时，从加样时算起（上样体积忽略不计）至溶质峰顶止←Ve→A0Ve上样体积中等时，从上样量的一半算起，上样体积溶质峰顶止上样体积大时，因洗脱溶质峰出现坪区,上样体积要从加样时算起，至溶质峰前缘最大峰高一半出现为止，此期间所流出的体积为该物质的Ve半峰高1/21/2VeVeI、VeII、VeIII：分别表示三部分样品的洗脱体积。

6、若样品Ⅰ为蓝葡聚糖2000等大分子物质，则VeI既表示样品Ⅰ的洗脱体积亦表示外水体积Vo。以---示洗脱曲线：表示上样量小时洗脱曲线，此时溶质峰峰顶及后缘位置均与上样量较多时不同。半峰高加样并开始洗脱VeII1/21/20半峰高VeII11ⅡⅢKav（有效分配系数）Kd=（Ve—V0）ViKav=（Ve—V0）（Vt—V0）Vt可利用量筒测量简便地得出Ve与分子量的关系对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面，Ve与分子量的关系可用下式表示Ve=K1—K2LogM选择曲线：以K

7、av对分子量的对数作图得一曲线每一类型的化合物都有它自己的特殊的选择曲线。可用以测定未知物的分子量，测定时以使用曲线的直线部分为宜。四、影响凝胶层析的因素凝胶的选择分离程度主要取决于凝胶颗粒内部孔隙的孔径和混合物分子量的分布范围这两个因素凝胶型号得水值（Wr克）交联度排阻下限sephadexG-252.55000sephadexG-505.010000sephadexG-757.550000凝胶粒度对分离效果的影响凝胶的粒度分为三级：40~60目属粗粒；100~200目属中粒(细粒)；200~400目属细粒(最细粒)中粒应用较多，因为它能

8、使洗脱曲线的峰区变得对称和狭窄。粗粒凝胶能使色带散宽，且彼此重叠。过细的凝胶，因洗脱阻力大，会延长实验时间。洗脱流速对分离效果的影响一般流速为30~200ml/hr.，即0.5~3.5ml/m