病毒感染细胞实验整体流程及 原理

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1、病毒感染细胞实验整体流程及原理1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和

2、非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。4）无需任何转染试剂，操作简便。5）可以根据客户需要制备多种标记。1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。4）病毒的纯化和浓缩。5）分

3、装、-80℃保存。6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。1.3、慢病毒和腺病毒的比较慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较病毒表达系统慢病毒表达系统（Lentivirus）腺病毒表达系统（Adenovirus）病毒基因组RNA病毒双链DNA病毒复制自主复制自主复制是否整合病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞，适用于难转染的原代细胞（如神经细胞）及体内实验感染分裂和不分裂细胞表达风度中水平表达高水平表达表达时间慢（1-3天）快（

4、1-2天）滴度滴度最高可达10*8pfU/ml滴度最高可达10*11pfU/ml克隆容量可插入不超过8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、构建目的基因到载体2.1构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。1）如果原始质粒载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应

5、片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定2.2质粒载体2.2.1概念能够进行自主复制的环状DNA双链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子2.2.2特征质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制。通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中

6、，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。(为了扩增DNA)3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。(为什么不进行PCR，因为不能做。)3.1大肠杆菌感受态细胞的制备1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min4）4℃离心10min（40

7、00r/min）5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min7）4℃离心10min（4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）9）分装细胞，200ul一份，4℃保存3.2质粒DNA的转化1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min2）离心管放到42℃保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）5）取适当体积（100u

8、l）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落3.3质粒提取步骤1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。3）加入250ul溶