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1、发酵液的预处理和固液分离方法从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个必要步骤就是预处理和固液分离.14.1发酵液的预处理从悬浮液中分离固形物的速度,取决于该液体的物理性质,常采用预处理的办法改变其物理性质而促其分离.细菌及某些放线菌菌体细小,发酵液粘度大,不能直接过滤.由于菌体自溶,核酸,蛋白质及其它有机粘性物质的存在会造成滤液浑浊,滤速极慢.因此,在预处理中应采用絮凝或凝聚的方法,设法增大悬浮液中固体粒子的大小,提高其沉降速度,或采用稀释,加热等方法降低粘度,以利于过滤.发酵液中杂质很多,其中对提炼影响最大的是高价无机离子(Ca++,
2、Mg十+,Fe++)和杂蛋白质等.高价无机离子的存在,会影响树脂对生化物质的交换容量.杂蛋白质的存在,不仅在采用离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时会降低其吸附能力,而且在采用有机溶剂或两水相萃取时,容易产生乳化,使两相分离不清,在预处理时,应尽量除去这些物质.14.1高价无机离子的去除方法为去除钙离子,宜加入草酸,可用其可溶性盐,如草酸钠.反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固,提高滤液(也称为原液)质量.但草酸价格较贵,加入硫酸铅,在60℃下反应生成草酸铅.后者在90-95℃下用硫酸分解,经过滤,冷却,结晶后可以回收草酸.草酸镁的溶解度较大.故加
3、入草酸不能除尽镁离子.要除去镁离子,可以加入三聚磷酸钠,它和镁离子形成可溶性络合物:Na5P3O10+Mg++=MgNaNa3P3O10+2Na十用磷酸盐处理,也能大大降低钙离子和镁离子的浓度.要除去铁离子,可加入黄血盐,使形成普鲁士蓝沉淀.14.l.2杂蛋白质的去除方法蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中.胶体粒子的稳定性和其所带电荷有关.蛋白质在某一pH下,净电荷为零,溶解度最小,称为等电点.因为羧基的电离度比氨基大,故蛋白质的酸性性质通常强于碱性,因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内(pH4.0-5.5).但单靠调节pH至等电点的办法不能将
4、大部分蛋白质除去.在酸性溶液中,蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸盐,水杨酸盐,钨酸盐,苦味酸盐,鞣酸盐,过氯酸盐等形成沉淀;在碱性溶液中,能与一些阳离子,如Ag十,Cu++,Zn十十,Fe++和Pb++等形成沉淀.变性蛋白质溶解度较小.最常用的使蛋白质变性的方法是加热.加热还能使液体粘度降低,加快过滤速度.该法只适用于对热较稳定的生化物质.使蛋白质变性的其它办法还有:大幅度改变pH,加酒精,丙酮等有机溶剂或表面活性剂等.在抗生素生产中,常将发酵液pH调至偏酸性范围(pH2-3)或较碱性范围(pH8一9)使蛋白质凝固,一般以酸性下除去的蛋白质较多.
5、加有机溶剂使蛋白质变性的方法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合.此外,还可以利用吸附作用除去蛋白质.例如,四环类抗生素生产中,采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3〔Fe(CN)5〕2的胶状沉淀来吸附蛋白质.在枯草杆菌发酵液中,常加入氯化钙和磷酸氢二钠,这两者本身生成庞大的凝胶,把蛋白质,菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去,从而加快了过滤速度.14.l.3凝聚和絮凝技术凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞,菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态,使聚集起来,增大体积,以便于过滤,常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中.凝聚和
6、絮凝的概念凝聚是在中性盐作用下,由于双电层排斥电位的降低,而使胶体体系不稳定的现象.絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下,基于架桥作用,使胶粒形成粗大的絮凝团的过程,是一种以物理的集合为主的过程.发酵液中的细胞,菌体或蛋白质等胶体粒子的表面,一般都带有电荷,主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离.通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷,由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒子(即正离子)被吸附在其周围,在界面上形成了双电层.但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的热运动的影响,具有离开胶粒表面的趋势,在这两种相反作用的影响下,双电层就分裂成两部分,在相
7、距胶核表面约一个离子半径的Stern平面以内,正离子被紧密束缚在胶核表面,称为吸附层或紧密层;在stern平面以外,剩余的正离子则在溶液中扩散开去,距离越远,浓度越小,最后达到主体溶液的平均浓度,称为扩散层.这样就形成了扩散双电层的结构模型,如图14-1所示.当胶粒在溶液中作相对运动时,总有一薄层液体,随着它一起滑移,这一薄层,厚度比吸附层稍大,滑移面(剪切面)在图14-l中用波纹线表示.这三种电位中只有ζ电位能实际测得,所以可以认为它是控制胶粒间电排斥作用的电位,用来表征双电层的特征,并作为研究凝聚机理的重要参数.胶粒能保持分散状态的原因主要
8、是带有相同电荷和扩散双电层的结构,一旦由于布朗(Brown)运动使粒子间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时,即产生使两个粒子分开:从而阻止了粒子的聚集.
