免疫细胞对基因修饰的A549肺癌细胞的体外杀伤研究

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1、摘要目的：1.构建可以侵染人细胞的逆转录病毒载体；2.构建Bcl-2(B-celllymphoma/leukemia-2)沉默基因，研究Bcl-2基因沉默后A549肺癌细胞抗免疫细胞杀伤能力的改变。方法：将构建的鼠噬逆转录病毒糖蛋白沉默基因和人噬逆转录病毒糖蛋白表达基因导入已有的鼠噬病毒包装细胞，使得该细胞能够产生可以侵染人细胞的病毒；利用基因重组构建Bcl-2沉默基因，转染上述包装细胞获得含有Bcl-2沉默基因的病毒，病毒感染人肺癌A549细胞得到稳定表达细胞系；从人外周血分离淋巴细胞，使用台盼蓝检测免疫细胞对肺癌A5

2、49细胞基因沉默前后杀伤效率的变化。结果：改造后的病毒包装细胞可产生有效侵染人细胞的逆转录病毒；Bcl-2沉默基因成功导入非小细胞肺癌A549细胞；免疫细胞对Bcl-2基因未沉默的非小细胞肺癌A549细胞共培养12h时的杀伤效果为A549细胞34.5%死亡，24h时为55.6%死亡。免疫细胞对Bcl-2基因沉默的非小细胞肺癌A549细胞，共培养12h时杀伤效果为A549细胞39.52%死亡，24h时为95%死亡。结论：通过逆转录病毒转染进行目的基因的导入是基因操作的有效方法，Bcl-2的沉默使得非小细胞肺癌A549肿瘤细

3、胞抗免疫细胞杀伤的能力减弱，为免疫细胞治疗肿瘤的探索提供了新的途径。关键词：Bcl-2；逆转录病毒；肿瘤免疫；RNA干扰;AbstractObjective:!.Preparationofretroviralvectorthatcaninfecthumancells.2.ConstructionofBcl-2silencegenevectorandtostudytheeffiectofBcl-2geneonkillcapacityofimmunecellsagainstA549cells.Methods:Bothmous

4、eretroviralglycoproteinsilencinggenesandhumanretroviralglycoproteingeneweretransfectedintopackagingcellswealreadyhad,enablingthecellstoproducethevimscaninfecthumancells;ConstructrecombinantBcl-2genesilencingplasmid,andusethemodifiedpackagingcellstoprepareretrovir

5、usvector,thenthevirusobtainedinfectedhumanlungcancercellsA549.Immunecellswereseparatedfi*omhumanperipheralblood,andthekillingefficiencyofimmunecellsagainstA549cellsweredetectedbytrypanbluestainmethod.Results:Modifiedpackagingcellscanproduceretrovirusefficientlyin

6、fecthumancells;Bcl-2silencegenewassuccessfullytransfectedintoA549cells;Afterco-culturewithimmunecells34.5%ofBcl-2no-silencedA549cellsdiedin12h,55.6%in24h.39.52%ofBcl-2silencedA549cellsdiedin12h,95%in24h.Conclusion:Importtargetgenesbyretrovirustransfectionisaneffe

7、ctivemethodofgeneticmanipulation;Bcl-2genesilencedecreasesA549，sresistanceabilitytoimmunecellkilling,whichprovidesanewapproachtoexploretheimmunecellsinthetreatmentoftumor.Keyvvords:Bcl-2,Retrovirus5Tumorimmunity,RNAinterftrence目录摘要IAbstractII目录II第一章绪论11.1研究背景及研究意

8、义11.2国内外研究进展21.3本文组织结构31.4木章小结4第二章逆转录病毒包装细胞的改造52」材料与方法82.1.1主要试剂82.1.2试剂配制82.1.3逆转录病毒包装细胞的改造92.1.4质粒表达载体的构建112.1.5重组质粒的扩增和提取112.1.6基因载体导入病毒包装细胞112.1.7MMLVenv沉默