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1、《生物化学大实验》参考资料《生物化学综合大实验》课程组2014年12月资料來源：1、张龙翔张庭芳李令媛.《牛化实验方法和技术》，1997年，笫2版；※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※孤※※※※※※※海实验一SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分子量的测定原理前已指岀,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。1967年.Shapiro等人发现,如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,简称SDS),则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的甌，
2、①而与所带电荷和形状无关。在一定条件F，蛋白质的与电泳迁移率间的关系，可用下式表示：(1)lgMr=gK—lm=Ki—bm(2)式中为蛋白质的相对分子质也K,K】为常数仏为斜率洌为迁移率。因此，要测定某个蛋白质的胚，只需比较它和一系列已知的蛋白质在SDS-凝胶电泳时的迁移率就可以了。后来.Weber等人基本按Shapiro的方法对约40种蛋白质进行了研究，进“步证实了这个方法的可行性(见图3-31)。现在，经SDS-凝胶电泳研究过的蛋白质,已有很多种。用这种方法测定蛋白质的M八简便、快速，只需要廉价的设备和Pg越的蛋白质样品;所为结果，在M「为15000〜200000的
3、范围内，与用其他方法测得的",相比，误差一般在±10%以内。因此,SDS•凝胶电泳测定Af的方法，已得到非常广泛的应用和迅速的发展。为了阐明SDS•凝胶电泳法测定蛋白质Mr的原理,许多人进行了深入的研究。实验证明•在蛋白质溶液中加入SDS和兢基乙醇后•蔬基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原£DS能使蛋白质的氢犍、蔬水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下,SDS与大多数蛋白质的结台比为1.4gSDS/lg蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS・复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种
4、类蛋白质间原有的电荷差别。图33137种蛋白质的对数对电沐迁移率图范围为11000-70000,10%軽胶，PH7.2SDS-S酸盐缓冲系统SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质・SDS复台物的渝体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似干雪茄烟形的长梅圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1-8nm,而长轴则随蛋白质的胚成正比地变化。这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率•不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质M的函数。将蛋白质-SDS复合物在不同浓度的SDS•凝胶中电泳，得到的结果按Ferguso
5、n公式作图.也证明了蛋白质-SDS复合物的上述性质。Ferguson公式：lg/w=lg加。—K”该公式原来是Ferguson提岀来描述蛋白质在淀粉凝胶中电泳行为的，后来证明它也同样适用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。式中刃是蛋白质在一定浓度凝胶（e）中的迁移率申。是当凝胶巡度外推到零时的迁移率即自由迁移率•它与蛋白质的净电荷蚩（0成正比，与蛋白质在溶液中的摩擦系数（/）成反比由溶液的粘滞性、蛋白质分子的大小和形状决定"Kr是阻滞系数（比.tardationcoefficient）,它与蛋白质相对分子质量成线性关系。因此,不同的蛋白质分予有不同的加，叫和Kr值，几种蛋白质的Ferg
6、uson图见图3-32。而蛋白质-SDS复合物的Ferguson图则不同（见图3-33）«从图3-33可以清楚地看到,不同蛋白质的SDS复合物的叫值都很接近,胚相差5倍的蛋白质之间，叫值只相差10%,如果忽洛这个差别，就可以认为，各种蛋白质-SDS复合物的叫基本上是一个定值"这表明,不同蛋白质的SDS复合物都带有相同密度的负电荷，并具有同样的构象，因此，它们的净电荷量与摩擦系数之比（“C都接近于一个定值而不受各种蛋白质原来的电荷、分子大小和形状的影响，因而，在溶裁中，自由迁移率就表现岀-・致性;但在一定威度的凝胶中，由于引入了凝胶的分子筛效应•电泳迁移率m就成为蛋白质M的
7、函数，根据以上事实，可以认为SDS■凝胶电泳测定蛋白质M,方法的基础是可靠的。当然,还有许图532几种蛋白质分子的电泳迁移率对凝胶浓度图5%交联度、pH8.83.Tris-盐酸缓冲系统.1.*乳球蛋卵清蛋白,3・卵类粘蛋白，4.胃蛋白酶,5.牛血清清蛋白单体,6・肌红蛋白,7-牛血清清蛋白一聚休，8・牛7-球蛍白.图3-33儿种蛋白质-SDSM合物的电泳迁移率对凝胶诙度图2.5%交联度,pH7.4,Tris-乙駿钠EDTA缓冲系统,L肌红蛋白（Mrl?200）.2・胰卷乳蛋白誨原A（25000）,3.乳酸脱氢酶（36000）,
