降钙素原抗原表达及其抗体制备及初步鉴定

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1、降钙素原抗原表达及其抗体制备及初步鉴定【摘要】目的：构建降钙素原(PCT)原核表达载体，制备其多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法：以甲状腺癌细胞cDNA文库为模板，构建重组表达质粒pGEX4T1PCT和PET32aPCT,在大肠杆菌中分别表达GSTPCT和HisPCT融合蛋白，用HisPCT免疫家兔和BALB/c小鼠制备兔pAb和鼠mAbo通过ELISA法测定抗人PCT抗血清效价；用Westernblot.间接免疫荧光鉴定pAb的特异性。使用间接ELISA法筛选分泌特异性抗PCT的杂交瘤细胞株，采用Westernblot和间接免疫荧光鉴定mAb的

2、特异性。结果：构建了重组表达质粒pGEX4T1PCT和PET32aPCT,并在大肠杆菌中表达、纯化。经ELISA法测得抗人PCT抗血清效价是1：256OOOo制备的抗PCT兔多克隆抗体可特异地识别重组和天然的PCT蛋白。获得8株可稳定分泌抗PCT的杂交瘤细胞株，可识别重组人PCT蛋白，其中有4株可特异性结合TT细胞质中的天然蛋白。结论：成功地制备出兔抗人PCT抗血清和8株抗PCT的mAb,为进一步研究PCT在严重的细菌感染和脓毒症中的病理及生理作用奠定了基础。【关键词】降钙素原原核表达抗体制备鉴定降钙素原(procalcitonin,PCT)来自定位于第11号染色体上(11P

3、15,4)的单拷贝基因，该基因由2800个碱基对组成，含6个外显子和5个内含子，基因全长Mi■约7600o转录后在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成降钙素原前体proprocalcitonin,包括N端84个氨基酸、活性降钙素(CT,32肽)和降钙蛋白(katacalcin,21肽)三部分，分别由2肽(LysArg)及4肽(GlyLysLysArg)连接。降钙素原前体在内源多肽酶作用下剪掉nProCT端单一序列，生成116个氨基酸的PCToPCT是无激素活性的降钙素前肽物质［1］。在正常情况下，具有激素活性的降钙素是在甲状腺滤泡旁细胞产生与分泌，并由细胞内特殊蛋白酶分解PCT

4、成降钙素。正常人血中PCT浓度非常低，然而在严重的细菌感染和脓毒症时,在外周血液中发现完整的PCT浓度升高。我们构建了重组表达载体，获得融合表达蛋白后，免疫家兔和BALB/c小鼠，制备抗PCT抗血清和抗PCT的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定，为进一步研究PCT的功能及其应用提供有力的工具。1材料和方法1.1材料TT细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；大肠杆菌BL21感受态菌株为本实验室自制。原核表达载体pGEX4T1和PET32a购自Amersham公司。限制性内切酶EcoRl和Xhol、ExTaq酶、T4连接酶等购自TaKaRa公司。PCR回收试剂盒、质

5、粒提取试剂盒购自Omega公司。BALB/c小鼠和大耳白兔子（2〜2.5kg,雄性）购自军事医学科学院动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0为军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫室制备。鼠抗His标签mAb、HRP羊抗鼠IgG、HRP羊抗兔由G、FITC羊抗鼠IgG.ECL显色系统均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2方法1.2.1PCT抗原的制备和纯化根据HumanProteinReferenceDatabase中提供的PCT的氨基酸序列，并结合应用生物信息学软件DNAstar的表位分析，以GenBank发表的核酸序列为准，综合设计引物。在其上游引物设计EcoRI酶切位

6、点，下游引物设计XhoI酶切位点，片段长度270个碱基（PCT的27〜116位氨基酸），从TT细胞提取总RNA,反转录合成cDNA,以cDNA为模板扩增目的片段。回收的目的片段、pGEX4T1和PET32a载体经EcoRI和XhoI双酶切后，分别进行连接，转化大肠杆菌，阳性克隆经测序正确后抽提质粒，进行诱导表达。PCT在BL21细菌中以可溶性形式表达，表达后用亲和层析法进行了纯化。1.2.2HisPCT融合蛋白的Westernblot分析将重组蛋白经常规SDSPAGE凝胶电泳后将蛋白质转移至PVDF膜上，封闭液封闭后，加入鼠抗HismAb与膜上的蛋白进行抗原抗体反应后，用HR

7、P羊抗鼠IgG进行检测，ECL显色，至目的条带染色清晰时终止反应。1.2.3兔抗人PCT抗血清的制备将纯化的PCT融合蛋白和等体积弗氏完全佐剂充分混合后，每只家兔皮下多点注射融合蛋白800ng；初次免疫4周后加强免疫1次，接下来1周后耳缘静脉采血检测抗体效价。2周后颈动脉采血,分离血清，分装后置-2（TC保存。1.2.4兔抗PCT血清的特性鉴定（1）ELISA检测抗血清效价：ELISA检测板用GSTPCT融合蛋白以0.1mg/L的浓度包被。按梯度稀释抗血清，每孔加入100nL（阴性对照为正常兔血清，空白