色谱法分析应用

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1、色谱法分析应用由于现代色谱分析技术具有分离和分析两种功能，即能排除复杂组分间的相互干扰，逐个将组分进行定性和定量分析，因此，现代色谱分析技术非常适合成分复杂的生药的有效性评价。色谱法根据其分离原理可分为：吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法与排阻色谱法等。吸附色谱法是利用被分离物质在吸附剂上吸附能力的不同，用溶剂或气体洗脱使组分分离；常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱是利用被分离物质在两相中分配系数的不同使组分分离；其中一相被涂布或键合在固体载体上，称为固定相，另一相为液体或气体，称为流动相；

2、常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上交换能力的不同使组分分离；常用的树脂有不同强度的阳离子交换树脂、阴离子交换树脂，流动相为水或含有机溶剂的缓冲液。分子排阻色谱法又称凝胶色谱法，是利用被分离物质分子大小的不同导致在填料上渗透程度不同使组分分离；常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，根据固定相和供试品的性质选用水或有机溶剂作为流动相。常用色谱法又可根据分离方法分为：薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法等。采用薄层色谱法分离有色物质时，可根

3、据其色带进行区分；分离无色物质时，可在短波(254nm)或长波(365nm)紫外光灯下检视，也可喷以显色剂使之显色，或在薄层色谱中用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光猝灭法检视。气相色谱法和高效液相色谱法可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。近年来随着各种色谱仪器自动化程度的提高，特别是各种联用技术的发展，使得用现代色谱分析技术进行生药有效性评价和质量控制变得越来越快速、简便和灵敏。（一）薄层色谱法(thinlayerchromatography,TLC)薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试

4、品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。《中国药典》(2005年版)一部薄层色谱法用于定性鉴别的达1523项，用于含量测定的为45项，其中有4种药材采用薄层扫描法定量。1.操作方法(1)薄层板有市售薄层板（普通或高效板）和自制薄层板，可根据需要选用。(2)点样通常在洁净干燥的环境，用专用毛细管或配合相应的半自动或自动点样器械将样品点样于薄层板上，一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边10～15mm，高效板一般基线距底边8～10mm。圆点状直径一

5、般不大于3mm，高效板一般不大于2mm；接触点样时注意勿损伤薄层板表面。条带状宽度一般为5～l0mm。高效板条带宽度一般为4～8mm，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品间隔不少于5mm。(3)展开将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭。除另有规定外，一般上行展开8～15cm，高效薄层板上行展开5～8cm。溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展

6、开剂，密闭，一般保持15～30分钟。溶剂蒸气预平衡后，应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内侧放置与展开缸内径同样大小的滤纸，密闭一定时间，使达到饱和再如法展开。必要时，可进行二次展开或双向展开。(4)显色与检视供试品含有可见光下有颜色的成分可直接在日光下检视，也可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色或加热显色，在日光下检视。有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在365nm紫外光灯下观察荧光色谱。对于可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板

7、(如硅胶GF254板)，在254nm紫外光灯下观察荧光板面上的荧光猝灭物质形成的色谱。(5)记录薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。也可用薄层扫描仪扫描记录相应的色谱图。2.系统适用性试验用供试品和对照品对实验条件进行试验和调整，使检测灵敏度、分离度和重复性符合要求。(1)检测灵敏度用于限量检查时，采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一薄层板上点样、展开、检视，后者应显清晰的斑点。(2)分离度用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点，应显示两个清

8、晰分离的斑点。用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度(R)的计算公式为：R＝2(d2-d1)／(W1+W2)式(3-5)式中，d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离；d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离；W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。通常分离度应大于1.0。(3)重复性同一供