大肠杆菌电转化

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1、大肠杆菌电转化感受态细胞制备实验步骤和转化方法实验步骤：1、将适合菌株（如XL1-Blue,DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37℃下过夜培养。2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。3、转移0.2-1ml过夜培养物至装有500mlLB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中。4、37℃下剧烈振荡培养2-6小时。5、定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次），当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。6

2、、细胞在4℃5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存一两天）。7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。8、照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。10、离心，弃上清液。用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14.照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。12、将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80℃保存。转化方法:1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μlDNA，冰上培

3、育约5分钟。2、添加1-3μlDNA，冰上培育约5分钟。3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。4、加载P1000，准备好300μlLB或2xYT。5、对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆,25μFd,2.5千伏）（检查时间常数，应该在3以上）。6、立即添加300μl的LB或2xYT至电穿孔容器中。7、37℃下培养细胞40分钟至1小时以复原。8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。