转基因动物

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1、转基因动物•转基因生物体(transgenicorganism)：是指携带了人为引进的外源DNA序列，从而改变了其（所有细胞的）遗传组成的个体•转基因动物(transgenicanimal)：利用DNA重组技术将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵或者早期胚胎内，使外源目的基因随细胞的分裂而增殖并在体内表达，且能稳定地遗传给后代的动物•1974年，MIT的RudolfJaenisch报导了转基因实验：将SV40的DNA注射到小鼠胚泡的胚泡腔中，发育而成的许多组织和细胞中都含有SV40的DNA，从而证明外源DNA可以随细胞分裂而传递•第二年，他们报导鼠白血病病毒感染小鼠着床前

2、的胚胎后，获得了整合了病毒的DNA并稳定传代的转基因品系说明：外源基因可以整合到寄主的染色体上，并与寄主的染色体一起传代•1985年，首次报导转基因家养动物•转基因动物从实验室到田间，从基础研究到应用瞬时和稳定转化•动物细胞的DNA介导转化具有两个阶段:1)DNA转入细胞(转染期)2)DNA掺入基因组(整合期)•转染的效率远远高于整合,因此大量的转染细胞都不会整合它们所包含的外源DNA,DNA在核中保持外源染色体的状态,假定它们没有宿主细胞中可以发挥作用的复制起始位点,那么只能保留很短的时间就会稀释或者降解----瞬时转染•对于许多类型的短期实验,比如确定连有报告基因的启动

3、子序列的效率,瞬时转染就足够了•稳定转化----在少量的转染细胞中，DNA会整合到基因组中，形成一个新的遗传位点,并且遗传给所有的无性繁殖后代整合的效率极低,稀有的稳定转化细胞必须从大量的非转化细胞和瞬时转化细胞背景中筛选出来转基因动物的关键技术•外源目的基因的分离•外源基因与基因表达的启动子、增强子、报告基因等的重组•重组DNA导入生殖细胞或者胚胎干细胞•胚胎移植技术•转基因胚胎发育生长鉴定以及筛选转基因动物品系•目的基因整合率及表达效率的检测外源基因导入的方法DNA显微注射法受体介导法磷酸钙共沉淀法逆转录病毒感染法腺病毒载体法电脉冲法胚胎干细胞介导法体细胞移植法精子介导

4、法瞬时和稳定转化•动物细胞的DNA介导转化具有两个阶段:1)DNA转入细胞(转染期)2)DNA掺入基因组(整合期)整合的效率极低,稀有的稳定转化细胞必须从大量的非转化细胞和瞬时转化细胞背景中筛选出来•目的基因的制备：线性DNA分子（酶切后尽量不带有载体的序列）清洁、高纯度•小鼠的准备提供受精卵的双亲最好来自不同的品系（杂交种耐力、生存能力强）•转基因小鼠的鉴定DNA水平PCR（假阳性）点杂交（假阴性）逆转录病毒感染法•逆转录病毒核酸类型：单链RNA分子•基因组成：顺式作用序列，反式作用序列（结构基因）将外源基因取代病毒反式作用序列构建重组DNA逆转录病毒介导的基因转移的技术

5、步骤•逆转录病毒载体的构建•选择和培养包装细胞系（它能为逆转录病毒载体提供包装蛋白，重组病毒DNA可以在该细胞中组装成重组病毒颗粒）•重组病毒DNA导入包装细胞•感染靶细胞，使细胞转化，并且表达外源基因胚胎干细胞法•胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团中分离出来的一种二倍体细胞，可以在体外培养并保持全能分化的潜能，在适当的环境条件下可以形成胚系集落•胚胎干细胞系的特征：具有高度的分化能力，可以通过改变生长环境来进行分化的诱导基因打靶技术•通过在转染细胞中发生的外源基因与核基因组之间DNA同源重组，进行单或双交换，实现基因的插入或者替换，能够使外源基因定点地整合到核基因组

6、的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。当这种方法转化干细胞产生转基因动物，其外源基因就达到了在个体水平的定点整合，即所谓的基因打靶技术（genetargeting)•基因剔除（geneknockout）是基因打靶的一种方法•条件性基因剔除（目的基因的剔除发生在被诱导处理后）精子载体法•精子与外源DNA混合培养，外源DNA可以直接进入精子的头部，通过受精将外源DNA引入动物细胞中•直接用精子作为外源基因的载体细胞核移植法•尽管家兔、猪、羊、牛比小鼠的操作更易受到实验条件的影响，最近10年内人们已经对哺乳动物成功地进行了核转移操作•1995年重大进展：由培养的哺乳动物细

7、胞系进行核移植获得了两个活体小羊—Megan和Morag•该小组后来通过在一个成熟的乳腺上皮细胞中进行核移植,得到了小羊多利•这是第一个对成熟的分化细胞进行核移植而产生的哺乳动物，它引发了科学家和公众之间关于克隆人的可能性的争论•多利于1996年7月出生，2003年2月,由于肺病，研究人员对它实施了“安乐死”•作为克隆技术及其应用的象征，多莉羊带来了争论，也留下了谜团，其中最大的一个谜就是克隆动物是否早衰受体介导法•将外源DNA与受体分子连接后与胚胎细胞共培养，利用受体将外源基因转入受体细胞，实现基因的转移•例如：