我国集约化猪场新发猪丁型冠状病毒病的诊断.pdf

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1、猪场兽医VETERINARY我国集约化猪场新发猪丁型冠状病毒病的诊断贺东生，陈小芬，王飞，苏丹萍，陈瑞爱，尤刘阳（华南农业大学兽医学院，广东广州510642）摘要：猪丁型冠状病毒（PDCoV）是一种国外新发现的猪腹泻病原，我国广泛存在猪流行性腹泻，但至今未见猪丁型冠状病毒感染的正式报道。2015年7月，在存栏2000头基础母猪的华南某集约化猪场5至15日龄乳猪发生传播迅速的严重腹泻，发病率90%、死淘率90%以上。经实验室PCR诊断为猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和轮状病毒（RV）检测均为阴性。用特异性的P

2、DCoVN基因引物经RT-PCR扩增显示为强阳性。在此基础上，对扩增产物进行了基因测序和遗传变异分析，显示该毒株在PDCoV新的遗传分支上，与其他PDCoV有显著区别。本研究首次报道我国出现了猪丁型冠状病毒病的新病例,毒株命名为PDCoVCh-A。关键词：猪；丁型冠状病毒；诊断；N基因猪丁型冠状病毒又称猪德尔塔冠状病毒（PDCoV），是在-80℃保存。一种新发现的冠状病毒，它主要感染整段小肠，尤其是空肠1.5RT-PCR的检测和回肠，引起严重的肠炎并伴有小猪的腹泻和呕吐[1]。2009—反转录体系：ddHO4 µL，下游引物R 1µL，

3、RNA22010年PDCoV在中国香港首次报道该病毒[2-3]。2014年初，1µL，70 ℃水浴10 min冰浴2 min；5×MLVbuffer2µL，在美国首次报道猪群该病的流行，此后至少有19个州有该新ddHO1µL，dNTPs0.5µL，RNA酶抑制剂 0.25µL，2型冠状病毒的报道。在美国，猪丁型冠状病毒感染与猪流行MLV反转录酶 0.25µL，42 ℃水浴1 h，72 ℃水浴15 min性腹泻（PED）和猪传染性胃肠炎（TGE）的临床发病情况冰浴至冷却。比较相似，但是发病症状相对较轻。新型猪肠道冠状病毒病PCR体系：dd

4、HO 32.5µL，10×MLVbuffer 5µL，2可引起乳猪腹泻和呕吐，发病率和死亡率高达50%～100%，dNTPs4µL，F 2µL，R2µL， cDNA 4µL，rTaq0.5µL。生长猪和成年猪感染后死亡率低。现将本次病例报告如下。反应条件为94 ℃5 min，94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃1材料与方法30 s，30Cycles ，72 ℃7 min，PCR反应产物于1.0%琼脂1.1病料糖凝胶电泳。来自华南某集约化猪场（2 000头基础母猪）3～7日龄1.6克隆的乳猪5头，全场乳猪发生严重腹泻，传播迅速，发

5、病率将阳性PCR产物经纯化回收后与PMD-18T载体连接，90%、死淘率90%以上。采集发病猪的小肠，按1∶5研磨转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养后挑单个菌落进制备成病料，-80 ℃冻存待检。行PCR鉴定，鉴定成功的重组质粒送往睿博兴科生物技术有1.2主要试剂限公司进行测序。RNA抽提试剂盒购于上海百赛生物科技有限公司，反1.7序列分析表1PDCoV参考毒株N基因序列信息转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、18T载体克隆试剂盒、将RT-PCR扩序号毒株名称时间来源DL2000DNAMarker、胶回收试剂盒、DH5α感受态细胞增获

6、得的N基因进1CHJXNI2-20152015中国等购自TAKARA公司。行克隆、测序，利用2CH-Sichuan-S27-20122012中国3HKU15-1552010中国1.3引物设计与合成MEGA6软件处理，与4HKU15-442009中国本实验室根据GenBank所发布的序列号，选择N基因，GenBank上已公布的5KNU14-042014韩国运用PrimerPremier5.0 分别针对PDCoV、PEDV、TGEV、PDCoV毒株的N基因6USA-Illinois121-20142014美国和RTV（猪轮状病毒）设计4对引

7、物，由睿博兴科生物技术序列（表1）进行同源7USA-Illinois133-20142014美国8USA-Illinois134-20142014美国有限公司合成，预计扩增的特异性基因片段大小为482 bp、性比对分析，并绘制9USA-Illinois136-20142014美国450 bp、810 bp和620 bp。系统进化树。10USA-Ohio137-20142014美国1.4总RNA的提取2结果与分析11IN2847-20142014美国病料经离心取上清液，按照ANYGEN核酸提取试剂盒2.1病猪症状和病变12OH1987-2

8、0142014美国说明书提取病毒总RNA，然后用物RNA酶的水溶解，放该集约化猪场5138734-USA-IA-20142014美国76猪业科学  SWINE INDUSTRY SCIENCE  2015年