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1、FLT3基因突变与IL3受体a在急性髓系白血病的表达意义作者：吴勇，陈景龙，骆社丹，陈元仲【摘要】目的研究FLT3基因突变与IL3受体a(IL3Rcc)在急性髓性细胞白血病(AML)的表达及临床意义。方法采用RTPCR及限制性片段长度多态性(RFLP)分析检测20例AML患者IL3Ra的表达水平及FLT3/ITD与D835突变。结果20例中TL3Rcx高表达18例,FLT3/TTD突变7例，D835突变1例，总突变率44.4%,对照组未检测到FLT3/ITD突变。高表达IL3Ra与FLT3/ITD阳性患者外周血白细胞计数高，白血病细胞比例高，完全缓
2、解率低。结论IL3Ra高表达和FLT3基因突变均赋予急性髓系白血病细胞增殖优势，检测两者水平对于评价AML患者疗效、估计预后具有重要意义。【关键词】受体蛋白质酪氨酸激酶；串联重复序列；突变；受体，白细胞介素3;白血病，粒细胞，急性急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)是一种涉及多基因遗传学改变的恶性血液病，其特征为细胞分化成熟受阻，未分化细胞大量增殖。目前认为白血病幼稚细胞起源于被称为白血病干细胞(leukemiastemcell,LSC)的细胞，而LSC则被认为是由相应的正常细胞发生至少两次突变后形成的异常产物。FLT
3、3基因(FMS样酪氨酸激酶3,FMSliketyrosinekinase3)是III型酪氨酸激酶家族成员的原癌基因,FLT3基因突变是AML最常见的基因突变，主要包括内部串联重复突变(internaltandemduplication,TTD)和D835突变。IL3受体是造血细胞因子受体超家族成员之一，IL3受体a亚基(IL3Rc(,又叫CD123)是白血病干细胞的特异性标志，其蛋白表达产物CD123在LSC中高度表达，而在正常的造血干细胞中不表达或表达很低［1］。本研究旨在探讨两者与急性髓系白血病的疗效和预后的关系。1材料与方法1.1临床资料1.
4、1.1标本采集和单个核细胞(MNC)的制备收集福建医科大学附属协和医院血液科2005年3月-2006年6月住院的20例急性髓系白血病患者外周血，年龄中位数35岁(32±3岁)。根据FAB形态学分型，20例患者包括急性原粒细胞白血病未分化型(Ml)3例，急性原粒细胞白血病部分分化型(M2)7例，急性早幼粒细胞白血病(M3)4例，急性单核细胞白血病(M5)6例，外周血幼稚细胞均＞60%,用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞(MNC),用PBS液洗涤细胞2遍,-80°C保存备用。同时采集4例正常人外周血单个核细胞为对照。1.1.2仪器与试剂T
5、rizol试剂（美国GIBC0L公司），反转录试剂盒（OmniscriptRTkiI,德国Qiagen公司），PCR试剂盒（HotSlarTaqMastermixkiI,德国Qiagen公司），限制性内切酶EcoRV（美国NewEnglandBiolabs公司），琼脂糖（美国AMRESC0公司）。1.2细胞总RNA提取及cDNA合成用Trizol试剂提取细胞总RNA,在紫外分光光度计上读取总RNA的260nm、280nm吸光度值（D）,要求D260/D280>1.8O用反转录试剂盒将上述样本的总RNA反转录成cDNA,逆转录反应体系20pL,
6、包括细胞总RNA110x逆转录反应缓冲液2gL,5mmol/LdNTPs2gL,10gmol/LoligodT20引物2pL,10U/pLRNA酶抑制剂1pL,4U/pL反转录酶1yL,余用无核酸酶水补至20MLo在37°C中反应60min,95°C反应5min灭活逆转录酶，-20°C保存备用。1.3RTPCR扩增IL3RcxmRNA的表达水平和FLT3ITD突变PCR采用HotStarPCR试剂盒，PCR反应体系25pL:HotstarTaqMastermix12.5pL,cDNA1.5ML,10pmol/ML±、下游引物各0.2“L,余用水补至
7、25»L。PCR反应条件：95°C预变性15min,然后进入循环（94°C变性30s->54C或61°C退火45s-72°C延伸60s）共30循环，72°C延伸10minoPCR所用的引物及PCR产物的预期片段为：IL3Ra:上游：5tCTGTCTCCTGCAAACGAAGG3,下游：5tGTTGACGCCTGTTGGCAACG3,预期片段479bpoFLT3/ITD:上游：5'GGTGGTTGTCTCCTCTTCATTGTCG3'下游：5'TTTGACGGCAACCTGGATTG3'预期片段288bp,包含近膜仃M）区和激酶结构域的起始部位，覆盖
8、文献报道的大多数ITD所在的区域。内参照人
9、3actin:上游：5£CTCGCCTTTGCCGATCC3'下游：5tGGA
