核酸检测及相关技术.ppt

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1、核酸检测及相关技术基本技术：核酸提取（DNA/RNA）、鉴定、PCR(RT-PCR/REAL-TIMEPCR)、琼脂糖电泳相关技术：基因克隆、转化；SSCP、RELF、杂交（southern/northern、原位杂交）、芯片检测内容一、基本技术（一）核酸提取1.基因组DNA提取2.非基因组DNA提取3.RNA提取（二）PCR扩增1.普通PCR2.荧光定量PCR(三)核酸、PCR产物的鉴定1.琼脂糖凝胶电泳2.紫外分光光度法二、相关技术三、分子平台使用流程及仪器设备操作规范（一）核酸提取提取DNA目的：主要是对基因和基因组进行分析。提取RNA目的：主要是对基因表达进行分

2、析。基因组DNA提取基本步骤材料准备破碎、裂解细胞核酸分离和纯化沉淀或吸附核酸，去除杂质核酸溶解在适量缓冲液或水中组织培养的细胞细菌外周血（一）基因组DNA提取组织－－匀浆或液氮研磨培养细胞－－蛋白酶K外周血--裂解液细菌--裂解液氯仿或吸附柱异丙醇、吸附柱70％的乙醇洗涤蛋白质的去除盐离子的去除1、材料准备基因组DNA来源：组织/培养的细胞/外周血最好使用新鲜样本，低温保存的样品不要反复冻融提取外周血DNA时，要选择有核细胞（单个核细胞）培养的细胞培养时间不能过长，否则会造成核酸降解含病毒的标本DNA含量较少，提取前先富集（一）基因组DNA提取取组织块0.3-0.5c

3、m3剪碎，加TE缓冲液0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。将匀浆液转移到1.5ml离心管中。加20%SDS25μl，蛋白酶K(2mg/ml)25μl，混匀。60℃水浴1-3h。蛋白酶K使多种蛋白质水解，并且蛋白酶K可在SDS存在下有活性。a匀浆法TE缓冲液是弱碱性,对DNA的碱基有保护作用,不易破坏其完整性或产生开环及断裂。SDS能使DNA和蛋白质分开。b液氮研磨法组织标本的处理：（一）基因组DNA提取2、破碎裂解细胞液氮研磨组织注意事项确定起始样品量，在研磨前称量好。研磨过程中要及时添加液氮，边研磨边添加。可以将研钵放在大小合适的泡沫盒里面研磨，这样可以保温，减小液氮挥发

4、的速度。研磨成粉末，在液氮挥发尽，应立即加入裂解溶液（裂解溶液一定要含有抗氧化剂，防止DNA被氧化降解。常用的抗氧化剂有PVP，β-巯基乙醇等）。裂解液加入后继续研磨，直至标本融化成液态。b液氮研磨法培养细胞处理：将培养细胞悬浮后，用PBS洗涤一次。离心4000g，5min，去除上清液。加10倍体积的裂解缓冲液。50-55℃水浴1-2h。要散细吹胞团块，使细胞被充分裂（一）基因组DNA提取破碎裂解细胞外周血的处理红细胞裂解法将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min倾去含裂解红细胞的

5、上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。（一）基因组DNA提取破碎裂解细胞分离单个核细胞Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时

6、会影响细胞获得率。细菌的处理将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。取1.5ml培养物12000rpm离心2min。沉淀中加入500μl的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μl10%SDS和15μl的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。（一）基因组DNA提取破碎裂解细胞核酸分离、沉淀、洗涤和溶解暴露出的DNA（一）基因组DNA提取吸附材料或氯仿抽提吸附柱或异丙醇沉淀漂洗液或70%乙醇洗涤TE缓冲液或双蒸水水溶解分离洗涤沉淀溶解质粒DNA的提取细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体，提取后可用作构建基因表达载体。（二）非基因组DNA提取培养细菌使质粒扩增收集和

7、裂解细菌分离和纯化质粒DNA分离质粒的三大步骤材料准备使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）质粒DNA提取（二）非基因组DNA提取当用碱处理DNA溶液时，变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而共价闭合环状的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将其分开质粒DNA提取（二）非基因组DNA提取裂解法原理：裂解细菌质