蛋白酶活力的测定.doc

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1、实验:蛋白酶的活力测定一、实验目的1、学习蛋白酶活力的测定方法。2、深入了解酶的活力和比活力的概念。二、实验原理1、酶活力的大小，是以该酶在适宜的温度和pH下，酶催化一定时间后，反应底物的减少量或者反应产物的增加量来表示。2、本实验蛋白酶的活力大小是以分解出的酪氨酸的量来表示，其单位为：每分钟内分解出1微克酪氨酸的酶量称为1单位。3、本实验采用福林-酚与蛋白质水解出的酪氨酸生成兰色物，从兰色的深浅程度可以求知酪氨酸的多少，从而确定酶活力的大小。4、在测酶活力前，先用福林-酚与用已知的不同浓度的酪氨酸作用，作出兰色深浅程度（用光密度表示）与酪氨

2、酸浓度关系的标准曲线。5、将酶与底物反应产生的产物与福林-酚试剂作用后测光密度，从标准曲线上查出相当于多少微克的酪氨酸，就可以计算出酶的单位了。三、实验材料、仪器和试剂1.实验材料1398中性蛋白酶粗酶粉（上海新型发酵厂）、滤纸2.仪器（1）试管（1.5*15cm*24)(2)移液管（3）电热恒温水浴（4）721型分光光度计3.试剂（1）福林-酚试剂B（2）标准酪氨酸溶液称取50毫克酪氨酸（预先在105摄氏度烘至恒重），加0.2MHCL溶液后定容至100ml，在加水稀释5倍得到100微克/毫升的酪氨酸溶液。（3）酪蛋白溶液称取酪蛋白2克，置1

3、50ml三角烧瓶中，加入0.2M磷酸氢二钠61ml，在水浴上搅拌使溶解，再加入39ml0.2M磷酸二氢钠，得到pH7的酪蛋白液，倾出上清液备用。（4）0.4M三氯醋酸溶液（TCA）（5）0.4M碳酸钠溶液四、操作步骤1、酪氨酸标准曲线制作：按下列次序加入试剂，混合均匀，保温，然后在分光光度计上进行比色，测出650nm处的光密度值。以酪氨酸浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。管号123456酪氨酸100ug/ml(ml)012345水（ml）1098765酪氨酸最后浓度（ug/ml)01020304050混合均匀后，从上面各管各取1m

4、l加入下面各管酪氨酸溶液（ug/ml)111111010203040500.4M碳酸钠溶液（ml）555555Folin-酚试剂B（ml）0.50.50.50.50.50.5迅速混合于40摄氏度放置20分钟OD6501、蛋白酶活力测定（1）浸出酶液称取0.5克酶粉加入40ml水，在室温下放置1小时并时加搅动。将酶浸出液过滤，取滤液1ml用水稀释至20ml，即为稀释1600倍的酶液。（2）酶活力测定按下表顺序操作：管号酶液（ml）TCA(ml）酪蛋白（ml）40℃保温10分钟TCA(ml）酪蛋白（ml）40℃保温10分钟滤液（ml）0.4M碳酸

5、钠（ml）Folin-酚（ml）迅速混合40℃保温20分钟OD650012001150.501112150.52112150.53112150.5(3)酶活力计算酶活力光密度值，在标准曲线上查得酪氨酸的微克数，再按下式计算酶活力单位：蛋白酶活力（单位）=Tyr的微克数*(4/10)*酶液的稀释倍数五、注意事项1、配置磷酸盐缓冲液时，磷酸氢二钠以含结晶水的为好，不含结晶水的易受潮2、配置的福林试剂应为鲜黄色，不带任何绿色，置于棕色瓶中，可在冰箱中长期存放。若此存储液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢复原色仍可继续使用。3、酶促

6、反应时间要准确控制。