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1、曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系的建立研究生导师学院Theestablishmentofreal-timefluorescentquantitativePCRassaysforthedetectionofAspergillus21.研究背景2.研究目的3.实验路线4.第一部分曲霉菌标准株的培养与DNA提取5.第二部分曲霉菌FQ-PCR检测体系的建立及评价6.结果与讨论7.全文结论目录3研究背景4研究背景曲霉菌属(aspergillus)：属丝状真菌，是一种常见的条件致病性真菌，好发于免疫低下及缺陷的人群在免疫缺陷、恶性肿瘤、器官移植患者中的感染率呈上升趋势YuY,A
2、mJperinatol,2013MelladoE.RevlberoamMicol,2013Armstrong-JamesD.Trendsinmicrobiology,2014KauffmanCA.Fungalinfections.2013研究背景地方性真菌1%地方性真菌3.5%1990年-1999年2000年-2008年leukemiapatients,M.D.AndersonCancercenter,CID,2010,50:405-15杨尚伦.急性淋巴细胞白血病真菌感染临床特点分析[J].实用癌症志,2014(9):1182-1184.2008年-2013年6研究
3、背景侵袭性曲霉菌病（InvasiveAspergillosis,IA）：是感染曲霉菌所引起的一种慢性霉菌病最常见的致病性曲霉菌：烟曲霉菌、黄曲霉菌土曲霉菌、黑曲霉菌ArvanitisM.ClinicalInfectiousDiseases,2015Kwon-ChungKJ.PLoSPathog.20137研究背景培养直接涂片镜检影像学GM实验组织病理FQ-PCR曲霉菌辅助检查方法直接涂片和培养阳性率低取材有创、困难真菌感染诊断的研究热点缺乏特异性，特征性表现出现晚灵敏性、特异性高，但易受影响，出现假阳性及假阴性FQ-PCR技术在病毒感染的诊断检查技术方面已经成熟目前
4、没有标准的用于临床的曲霉菌FQ-PCR检测试剂盒（CFDA检索）前期已成功建立了念珠菌及新型隐球菌实时荧光定量PCR检测体系8研究背景LauAMethodsMolBiol,2013AittakorpiA.Journalofclinicalmicrobiology,2012建立曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系，关键在于曲霉菌DNA的提取和特异性引物探针的设计研究背景10研究背景曲霉菌DNA提取方法史俊艳.临床常见曲霉菌体外药物敏感性及分子生物学鉴定方法研究[D].中国协和医科大学,2010.Klimek-OchabM.FoliaMicrobiologica,20111
5、1研究背景曲霉菌DNA提取方法的选取物理方法液氮研磨法：次之，已有商品化试剂盒玻璃珠机研磨法：最佳，但耗时长超声波降解法化学方法CTAB缓冲液加微波法酶消化法：快速有效高渗震扰法Klimek-OchabM.FoliaMicrobiologica,2011RittenourWR.JournalofEnvironmentalMonitoring,2012O'ConnorL.US20110311969[P].2011理论18SrDNA、28SrDNA、5.8SrDNA、ITS1、ITS2实际A.fumigatuseasLgene、A.flavusaflEgene、A.te
6、rreusCBMAI0193gene、A.nigeralpha-1,3-glucansynthasegene研究背景GadeL,EukaryotCell,2013OgawaM.GraefesArchClinExpOphthalmol,2012RobinsonSL.Mycologia,2012YuquanX.Applied&EnvironmentalMicrobiology,2013扩增靶序列的选取1.探针不保守2.引物Tm值不达要求13初步设计合成的四种曲霉菌引物探针序列（每种2套）菌种引物探针序列Tm值(℃)A.fumigatus1F：CCTCCAGCCAAACC
7、TGAACTTP：GGCACCAGAACCTCCCGCTGAAAATGR：TTCGTCATTGTTTAGAGCCACCT60.167.460.2A.fumigatus2F：AGCCTCGGGATGTGGTTCAP：CTGGACCCATGACCAATCTTCTGTGTGR：TCGTCGGTCACTTTCCTTGC61.963.362.5A.flavus1F：TGGGCTGTTTTGCTGTATGGTTP：AATTCGTCTCATCAAAGAGGCATCCTCGCR：TGCTGAAGGACTAAAAGGACAAGG62.164.660.3A.flavus2F：ATC
