H9亚型禽流感病毒单克隆抗体及胶体金试纸条的研制.pdf

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1、H9亚型禽流感病毒单克隆抗体及胶体金试纸条的研制DevelopmentofmonoclonalantibodiesandacolloidalgoldteststripagainstH9subtypeavianinfluenzaviruses[本文受家禽病毒病基因工程疫苗创制(2011AAl0A209)和公益性行业科研专项经费项目(201003012)资助]研究生：任倩导师：彭大新教授陈素娟副教授刘秀梵教授扬州大学兽医学院2014年6月任倩：H9亚型禽流感病毒单克隆抗体及胶体金试纸条的研制H9亚型禽流感病毒单克隆抗体及胶体金试

2、纸条的研制研究生：任倩导师：彭大新教授陈素娟副教授刘秀梵教授摘要禽流感(AvianInfluenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的传染病，感染动物表现出从呼吸系统到全身败血症等多种症状。目前对养殖qp危害比较大的是H5和H9亚型禽流感。H9亚型禽流感病毒本身引起的死亡率较低，但能与其他病原混合感染易感动物，引起较高的死亡率，此外也有H9亚型禽流感病毒感染人的报道。目前主要采取疫苗免疫和严格的生物安全措施来控制该病。鉴于H9亚型禽流感病毒对养禽业的危害及其在公共卫生学上的意义，加强对此亚型病毒的检测和疫病的防控迫在眉

3、睫。本研究选取了H9N2亚型禽流感病毒两个主要分支的代表株F98和TX病毒，制备了单克隆抗体。在此基础上，我们研制了用来检测H9亚型禽流感病毒的胶体金试纸条。l针对H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备选择H9N2亚型禽流感病毒的两个主要分支代表株F98病毒(F98．1ike)、TX病毒(Y280系)。病毒经差速离心法纯化后免疫6．8周龄Balb／c母鼠，通过传统ELISA方法结合血凝抑制法筛选阳性克隆，最终得到13株能稳定分泌抗体的单克隆抗体杂交瘤细胞株，6株来自于F98病毒，分别命名为586、5Bl1、3F9、2F7、3

4、E6、5D3，抗体亚类分别为IgG2b、lgGl、IgGl、IgG2b、IgG2a、IgGl。7株来自于TX病毒，分别命名为1D5、6E5、5D8、383、1C9、181l、187，抗体亚类分别为lgG2a、IgG2b、lgG2a、IgGl、IgG2a、lgG2b、lgGl。特异性结果显示，这13株腹水与Hl、H5、NDV和IBV都不反应。Western．blot结果显示，源于F98的单抗5811、586、3F9、3E6、5D3与F98反应，源于TX的单抗1D5、5D8、383与TX反应，均在50kDa左右出现一条特异性条带

5、。间接免疫荧光实验结果显示，F98的6株单抗对F98病毒均有特异性荧光，Tx的7株单抗除ID5、IBl1外，其余对TX病毒均有特异性荧光。·11和试验表明，单抗3E6、5D3、2F7、3F9、383和1C9扬州大学硕士论文2对母本病毒具有中和效价，为1018一1047。交叉血凝抑制试验结果显示，5D3和2F7有广谱的血凝抑制作用。2检测H9亚型流感病毒胶体金试纸条的研制通过柠檬酸三钠还原方法制备胶体金，试纸条采用双抗体夹心原理，将2F7单抗标记的胶体金．抗体复合物以l：l5稀释度包被于金标垫上：将羊抗鼠IgG以1．5mg／m

6、L的浓度包被于NC膜的质控线，5D3单抗以Img／mL的浓度包被于检测线。当检测样品中含有H9亚型病毒时两条线均显色，而不含有H9亚型病毒时就只有质控线显色。特异性实验表明，试纸条口J^检测H9亚型病毒，与其它亚型禽流感病毒及其它禽类病毒均没有交叉反应。广谱性检测表明，除NTTZC和G1一like亚系外，此试纸条可与所检测的H9亚型病毒均反应。用H9病毒尿囊液作为检测原时，胶体金试纸条的最低检测限为105EID50的病毒量，其敏感性约为血凝试验的1．5倍。关键词：禽流感病毒；H9N2亚型；单克隆抗体；胶体金试纸条任倩：It9

7、亚型禽流感病毒单克隆抗体及胶体金试纸条的研制DevelopmentofmonoclonalantibodiesandacolloidalgoldteststripagainstH9subtypeavianinfluenzavirusesM．S．can．didate：QianRenAdvisor：ProfiDaxinPengAssociateProfiSujuanChenProf．XiufanLiuAbstractAvianInfluenza(AI)isaninfectiousdiseasecausedbytypeAinflu

8、enzavirusofOrthomyxoviruseswithavarietyofsymptomsfromrespiratorysyptomtosystemicsepticemia，inwhichH5andH9subtypeofAIisthemostimportantdiseasetopo