姐妹染色单体互换.ppt

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1、实验二姐妹染色单体互换标本制备与分析湖北科技学院基础医学院曾洁实验目的与要求1、初步掌握姐妹染色单体差别染色技术2、初步掌握SCE的观察及分析方法3、了解SCE频率变化的意义器材与试剂1、材料加BrdU的营养液培养的外周血淋巴细胞染色体标本片2、器材用品光学显微镜、恒温水浴箱、紫外灯、擦镜纸3、试剂2×SSC溶液、吉姆萨染液、BrdU、香柏油、二甲苯实验原理姐妹染色单体（sisterchromatid）：染色体在DNA复制之后产生的一对连在一起的染色单体。姐妹染色单体互换（sisterchromatidexchange,SCE）：是指染色

2、体复制过程中，同一条染色体的两条姐妹染色单体在相同位置上发生的等位对称的片段交换（同源片段的交换）。SCE交换频率是反映DNA损伤程度的最敏感指标之一。由于SCE能灵敏地检测染色体的变化，表现出剂量-效应关系，还可以将姐妹染色单体互换频率列为检测致突变物、致癌物的常规指标之一。SCE检测原理：在细胞培养过程中，加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸，当细胞的DNA复制时，BrdU可取代胸腺嘧啶而被掺入到新合成DNA链中。半保留复制的新链被BUdR掺入,当细胞处于第二周期时，同一染色体的两条姐妹染色单体，一条由双股都含有BrdU的DNA链构成，而另一条

3、为单股含有BrdU的DNA链。B/B型链的DNA螺旋化程度降低，经紫外线照射后与Giemsa的亲和力降低，染色后BB型链比T/B型链着色浅而出现色差。复制第一周期复制第二周期未掺入BrdU的为白链，掺入的BrdU的为黄链DNA双链TTTBTBTBBB实验步骤BrdU掺入：细胞培养24h后于培养液中加入BrdU，最终浓度10μg/ml，避光条件下继续培养。↓培养终止前2.5h加秋水仙素，秋水仙素终浓度为0.02μg/ml↓染色体制片紫外灯照射：取标本玻片置于饭盒盖内，正面朝上，覆盖擦镜纸，加入2×SSC缓冲液降纸浸湿，移入56℃水浴锅内，紫

4、外灯距离10cm，照射20min↓染色：取出照射后标本，缓流水冲洗，pH6.82%Giemsa染液染色10min，自来水冲洗晾干1、SCE染色体标本片制备2、SCE观察计数镜下（油镜）观察中期分裂相时，注意区分各细胞周期分裂相的染色特点：①染色体的两个单体均为深染的细胞记为第一周期的细胞；②染色体的两个单体染色一深一浅的细胞为第二周期细胞；③部分染色体的两个单体染色都为浅色的细胞为第三周期的细胞。复制第一周期复制第二周期未掺入BrdU的为白链，掺入的BrdU的为黄链DNA双链TT型TB型TB型TB型BB型选择染色体分散良好、长度适中、轮廓

5、清晰、数目完整、分化良好的的第二周期的分裂相进行计数。人体姐妹染色单体交换（SCE）的计数方法：①凡是在染色单体端部出现互换，记为1次交换；②在染色单体中间出现互换，记为2次交换；③如果在着丝粒处发生交换，需判明是否为扭转，不是扭转的为着丝粒部位交换，记为1次交换。每一份标本至少需要计数20~50个细胞的染色体，计算SCE平均交换频率。SCE平均交换频率（次/细胞）=交换总次数/细胞数实验报告要求1、按常规书写实验报告（实验目的、姐妹染色单体色差染色原理、实验试剂材料、实验操作步骤、实验结果）。2、实验结果中观察计数20个分裂相（不能少于

6、5个），并计算出该染色体标本SCE频率。3、在自己的制片中能看到三个不同周期的SCE图像吗？请对此现象进行讨论。