体外大鼠肠道菌群代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究.pdf

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1、第4O卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第1期2012年1月ChineseJournalofAnalyticalChemistryll9～123DOI：10．3724／SP．J．1096．2012．10208体外大鼠肠道茵群代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究冯培生沈建忠吴海霞李林霞戴燕玉刘凯丽王莹张素霞(中国农业大学动物医学院，北京100193)摘要运用超高效液相色谱串联四级杆／飞行时间质谱(UPLC—Q／TOF—Ms)识别和确定脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynialenol，DON)在大鼠肠道菌群体外代谢模

2、型中的代谢产物，同时运用高效液相色谱串联三重四级杆质谱定量分析DON含量变化，比较各段肠管中厌氧菌群的代谢能力。结果表明，DON不能被大鼠小肠菌群代谢，而能被其大肠菌群代谢为脱环氧代谢产物脱环氧一脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deepoxy-deoxynialenol，DOM)。定量测定结果显示，大肠中盲肠菌群代谢能力最强。关键词体外代谢；肠道菌；大鼠；脱氧雪腐镰刀菌烯醇；超高效液相色谱串联四级杆／飞行时间质谱1引言脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynialenol，DON)，化学名为3d，7a，15一三羟基一12，13一环氧

3、单端孢霉一9_烯一8一酮，俗称呕吐毒素，属于B型单端孢霉烯醇类毒素。DON是由镰刀菌属中的禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生的次级代谢产物[1。】。DON能够引起动物增重下降、食欲减退、营养吸收率降低、呕吐等慢性毒性作用；对真核细胞和原核细胞均具有明显的细胞毒性；DON能诱导免疫细胞凋亡、抑制其增殖，同时还影响免疫细胞因子的分泌口】。通常，毒性物质经体内生物转化后毒性会降低，然而有时生物转化后会形成毒性增强的代谢产物。利用气相色谱一质谱(GC—MS)已研究DON多种动物模型，但仅识别和鉴定出一种工相代谢产物脱环氧一脱氧雪

4、腐镰刀菌烯醇(Deepoxy—deoxynialenol，DOM)]。众所周知，在代谢产物研究中液相色谱一质谱(LC—MS)已成为最合适、最有效的分析方法。本研究运用超高效液相色谱串联四级杆／飞行时间质谱(UPLC～Q／TOF—MS)分析DON在大鼠肠道厌氧菌群体外代谢模型中代谢产物，同时利用高效液相色谱串联三重四级杆质谱(LC-MS／MS)比较各段肠管代谢能力的强弱。UPLC—Q／TOF—MS结合了超高效液相色谱提供的更快、更灵敏的色谱分离能力和四级杆飞行时间质谱精确质量数测定优势[9~11】，借助代谢产物识别

5、软件Metabolynx自动分析采集样品信息，特别是质量缺失过滤(Massdefectfilter,MDF)的应用能有效剔除假阳性结果，从而提高分析效率1。2实验部分2．1仪器、试剂与动物ACQUITYTM超高效液相色谱(配AcquityBEHC8色谱柱)，Alliance2690高效液相色谱(fl~SymmetryRPC。色谱柱)，SYNAPTTM四级杆飞行时间质谱(美国Waters公司)；Quattro三重四级杆串联质谱(英国Micromass公司)；Bactrom厌氧培养箱(美国Shellab公司)；AUe

6、gra64R台式高速离心机(美国Becrman公司)；氮吹仪(美国OrganomationAssociates公司)；旋涡混合器(北方同正生物技术发展公司)。DON标准品(纯度≥99％，以色列Fermentek公司)，乙酸乙酯(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，乙腈(农残级，美国Fisher公司)，氨水(28％，美国Alfa-Aesar公司)，厌氧培养基(北京陆桥有限责任公司)，超纯水由Milli—Q纯水仪(美国Millipore公司)自制。Wistar大鼠(体重220~250g，北京维通利华实验动物技术有限公

7、司)，禁食12h，自由饮水。201卜O3一O7收稿；201卜05-29接受本文系“973”国家重点基础研究发展计划课题(No．2009CB118801)资助E—mail：suxia@cau．edu．cn120分析化学第40卷2．3实验方法2．3．1大鼠肠道厌氧菌群培养液制备大鼠脱椎致死后迅速打开腹腔，分离肠管，转移至厌氧培养箱中。在培养箱中取出肠道内容物，按1：15(re~V)比例加入厌氧培养基溶液，用四层纱布过滤获得厌氧菌群培养液。2．3．2DON在厌氧菌群中孵育条件厌氧培养箱中混合气组成为5％H，5％CO：和

8、90％N：。培养温度设为37℃。10DON标准溶液(2．5g／L)加入5mL大肠或小肠厌氧菌群培养液中，阴性对照中加入等体积的甲醇。厌氧环境中，37℃孵育24h后，一20℃冷冻保存；10DON标准溶液(2．5g／L)加入8mL盲肠、结肠或直肠厌氧菌群培养液中，37℃孵育0，2，4，8，12和24h后，吸取1mL孵育液于1．5mL离心管中，一20℃冷冻保存。2．3．3样品预