置换型荧光偏振免疫检测除草剂丁草胺.pdf

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1、第4l卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第7期2013年7月ChineseJournalofAnalyticalChemistry103l—l036DOI：10．3724／SP．J。1096。2013．30068置换型荧光偏振免疫检测除草剂丁草胺雷红涛吴青卢蓝蓝刘英菊薛钢王强’徐振林孙远明(华南农业大学食品学院广东省食品质量安全重点实验室，理学院生物材料研究所，广州510642)摘要建立了一种置换型荧光偏振免疫分析方法(DFPIA)检测水样中除草剂丁草胺。研究了不同结构示踪物对丁草胺DFPIA灵敏度的影响，优化筛

2、选出一种荧光示踪物抗体组成的免疫复合物；考察了DFPIA置换反应动力学。所建立的DFPIA法特异性良好，检限为22．6g／L，半数抑制浓度(Ic。)为321．3L，检测范围为60～1472mL，检测时间为12．5rain，添加回收率在88．1％～112．5％间，免疫复合物可以在4oC下稳定保存至少1星期以上。本方法适于环境水样中丁草胺的筛选检测。关键词荧光偏振免疫分析；丁草胺1引言丁草胺(结构见图1)属于氯乙酰苯胺类除草剂，是一种高效芽前选择性除草剂，主要用于去除稻田杂草，是我国生产和使用量最大的除草剂品种之一。丁草胺在环

3、境中稳定性强、残留期长，对环境和生物有一定的危害性⋯。目前，对除草剂的检测主要是以气相色谱或液相色谱为基础的方法]。尽管仪器分析法准确可靠，但前处理操作繁琐，需较高技能的专业人员操作，成本较高。近年来，快速、简便的免疫分析方法在农药残留分析领域的应用已成为研究热点之一l4J。荧光偏振免疫分析(Fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA)作为一种均相免疫分析方法，无需分离洗涤步骤，反应时间基本上取决于分析试剂加入的时间，为高通量、自动化免疫分析的实现展示了良好的应用前景。。。但目前在食品

4、、环境污染物分析领域中研究应用很少引。本研究组曾建立了一种基于竞争原理的丁草胺荧光偏振免疫分析方法J，使用时先加人分析物和示踪物，然后加人抗体，标记抗原和分析物开始竞争结合抗体，平衡后进行检测。本研究采用基于置换原理的单试剂荧光偏振免疫分析方法(DisplacementFPIA，DFPIA)检测丁草胺，预先将抗体和荧光示踪物混合制备出免疫复合物贮存待用，使用时只需将分析物加入，经短时间反应，测定荧光偏振信号。考察了结合反应动力学、置换反应动力学、方法特异性、稳定性、添加回收率等，建立了一种丁草胺DFPIA分析方法。2实验部

5、分2．1仪器与试剂WallacVICTOR1420多标记分析仪(美国PerkinElmer公司)；U．3010紫外可见光谱扫描仪(日本Hitachi公司)；荧光微孔板(深圳金灿华实业有限公司)。丁草胺(分析纯，山东滨州农药公司)；牛血清的蛋白(BSA)、异硫氰酸荧光素异构体I(FITCisomerI)、5．氨基荧光素(AF)、N，Ⅳ．二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、乙二胺、己二胺(Sigma公司)；其它试剂均为市售分析纯；硼酸缓冲液(BB溶液，50mmolfL，pH8．0)作为稀释液用于所有样品稀

6、释。2．2实验方法2．2．1荧光示踪物制备丁草胺半抗原BMPA、不同长度手臂的荧光示踪物BMPA—AF、BMPA—EDF和BMPA—HDF(结构见图1)，按照文献[8]的方法制备。2．2．2抗血清制备免疫原为BMPA与牛血清白蛋白的偶合物(BMPA—BSA)，多克隆抗体制备按照文献[11]的方法制备。20l3旬l—l6收稿；2013-03-06接受本文系行业(农业)公益项目(No．201003008-08)、国家自然科学基金项目(Nos．30700663，21105030)、高等学校博士点基金项目(No．201144041

7、30002)、广州市科技计划项目(No．11C12100483)资助E．mail：ymsun@scau．edu．cn分析化学第41卷a一、、堍。H图1丁草胺、丁草胺半抗原和3种荧光示踪物结构Fig．1Structuresofbutachlor，butachlorhaptenBMPAandthreefluoresceintracers2．2．3示踪物浓度和免疫复合物的确定将100初始浓度为8．0nmol／L的示踪物进行倍比稀释，得到系列不同浓度的示踪物，加入等体积稀释度为1／400的抗血清，平衡1h后，用WallacVICT

8、OR。1420多标记分析仪测读不同浓度示踪物与抗血清结合后的荧光偏振FP值(FP以mP为单位)。加入过量丁草胺标准品(50mg／L)，待反应进行15min后，记录此时的FP值(FP0)。由于药物会将示踪物置换出来，检测到的FP0将低于FP两者的差值越大说明示踪物越容易与抗体解离，相应获得的信号强度就越高