流式细胞术基本原理课件.ppt

《流式细胞术基本原理课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、流式细胞术基本原理陈晓东产品技术专员广州市珈源医学试剂有限公司流式细胞术流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量流式细胞仪的特点单个细胞/生物颗粒分析同时多参数、多荧光分析高通量检测/高速度10000个细胞/秒以上定性/定量分析分选特定性状或功能的细胞可检测的样本种类多样(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液目

2、前流式细胞仪可以检测的类别细菌浮游生物DM：0.2μm——15μm单核细胞中性粒细胞淋巴细胞红细胞流式细胞仪的基本构造激光发射器发出所需要的波长的激光前向散射光检测器侧向散射光检测器光学滤镜流动室与液流系统：将细胞单个压入流动室信号收集与数据处理系统光源与光学系统InjectorTip荧光信号聚焦的激光光束鞘液流动室当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收，或被滤片反射。光学滤片光学滤片的种类长通滤片（LP）：630LP短通滤片（SP）：550SP带通滤片（BP）:488/10共有两类：散射信号与荧光信号前向角散射信号（FSC）反映细胞大小侧向角散射信号（SSC）反映细胞颗粒度荧光信号（

3、FLSignals）（FL1、2、3……）胞内、胞外染色情况流式细胞仪可获取的信号种类FSC和SSC直方图流式细胞仪显示图的种类把前向散射光图和侧向散射光图的一维图像在二维图像上投影，便是我们平常所看到的流式图。所以横坐标表示的是细胞的直径大小；纵坐标表示的是细胞的复杂程度。两者相结合就能说明细胞种类散点图二维等高图和密度图假三维图与三维图Pseudo3DPlot3DPlot流式细胞仪如何获取细胞信号？FSCSSCFL前向角信号（ForwardScatter，FSC）前向角信号：细胞的大小FSCCountFSCCount101000侧向角信号（SideScatter，SSC）SSCCountS

4、SCCount101000FLcountFLFSC、SSC、FL如何分离90°角内的各种荧光信号？荧光染料吸收某一波长的光波后能发射出大于吸收光波长的光波的物质激发光PI488n>600nm荧光染料种类荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色PerCP488670免疫荧光红色PI488620DNA染色橙红ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红色APC633670免疫荧光红色DAPI359462DNA染色蓝色荧光染料光谱特征荧光分离原则在流式细胞仪中，一般经过LP或SP滤片将荧光大致分开后，再经

5、过一BP滤片分离出特征荧光开放式光路Calibur、Influx流式细胞仪的光路封闭式光路（CantoⅡ、LSR系列、Aria系列）分选将目标细胞分离并富集，进行后续研究。分选纯度>99%震荡激光偏转板FluorescenceActivatedCellSorting488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector几个概念信号放大模式信号类型CV值样本流速激光延迟液滴延迟荧光补偿阈值门对照信号放大PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压，信号强度将随之改变光信号光电倍增管

6、（PMT）放大器电信号放大器两种放大方式：线性放大（lin）对数放大（log）线性放大（lin）按光强度的线性关系输出信号.适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物过程的信号，如DNA含量、总蛋白含量等。对数放大（log）按光强度的对数关系输出信号.在免疫学测量中通常使用对数放大。电脉冲信号类型将与电脉冲信号强弱相关的电压数字化有三类电脉冲信号高度信号H面积信号A宽度信号WCV值CV值（变异系数）：样品均一度及仪器分辨率的标志CV值一般<2%样本流速高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低.低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。样本流速选择激光延迟（lase

7、rdelay）Laser1Laser2液滴延迟（dropdelay）颜色补偿采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。FITC主要由FITC的检测器检测，但部分光也会进入PE检测器。如果单染FITC，同时打开PE检测器，则如图：理想状态实际情况补偿效果阴性对照阈值信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值