实验-重组DNA转化宿主细胞.ppt

《实验-重组DNA转化宿主细胞.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、重组DNA转化宿主细胞实验原理转化是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。受体细胞在完成转化的过程中必须处于感受态。大肠杆菌感受态细胞有多种制备方法。目前，最常用的方法是CaCl2处理法。感受态细胞经过转化后，就成为转化细胞，也可以被称为转化子。也就是带有异源DNA分子的受体细胞。实验原理DNA分子转化进入受体菌的过程如下：吸附——完整的DNA分子吸附在受体菌的表面；转入——双链DNA分子解链，单链DNA进入受体菌，另一条链降解；自稳——外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA；表达——供体基因随同复制子同时复制，并被转录转译

2、。实验原理本实验用的载体DNA为质粒pUC19，内含氨苄青霉素（Amp）的抗性基因（Ampr基因），经过转化的大肠杆菌能在含有Amp的平板上生长，说明转化成功。pUC19质粒还可导致受体菌产生α-互补现象，在含有IPTG和X-gal的平板上形成蓝色菌落。外源基因的插入破坏α-互补作用，在同样的平板上形成白色菌落。实验原理IPTG：Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷X-gal：5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D

3、-半乳糖苷实验原理实验原理操作步骤取三个1.5mL离心管，各加入100L大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。往1＃管中加入2LpUC19质粒；其余两管各加入5L连接物（上周所做），加入后反复吹吸几次混匀，冰浴60min。离心管在42C水浴放置100s后立刻冰浴2min。加入1mLLB培养基，混合后37C水浴45min，期间每隔15min左右反复颠倒离心管几次。12000rpm离心30s。吸去大部分上清，残留100L左右，再用枪头反复吹吸，使之成为细胞悬液，涂布在平板上。平板37℃倒置培养12-16hr，挑选不产蓝色色素的白色单菌落，初步确定为所需转化子。

4、操作步骤平板的准备：熔化LB固体培养基，每100mL中添加100mg/mLAMP100L、48mg/mLIPTG100L、20mg/mLX-gal200L。铺制平板三块。注意事项注意无菌操作，避免染菌。注意用火安全。Amp溶液解冻后会有沉淀，稍稍加热使沉淀溶化才可使用。严格控制热激活温度和时间。思考题转化后，如果平板培养时间延长，会在阳性菌落附近出现许多小的“卫星菌落”，为什么？下次实验转化子的PCR法鉴定