相对定量 ΔΔCT法和相对标准曲线法.pdf

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1、Module5：相对定量-ΔΔCT法和相对标准曲线法Theworldleaderinservingscience1相对定量PCR:相对基因表达量2示例实验未处理样本处理后样本目的基因：Plat1问题:样本处理后，目的基因的表达量有什么变化?3目的基因与目的基因的比较DRnDCt=24–23=1Ct=24CyclesCt=23未处理组：目的基因处理组：目的基因4如果加入内参基因会怎样呢?DRnDCt=23–13=10DCt=24–14=10Ct=14Ct=24CyclesCt=13Ct=23未处理组：目的基因和内参基因处理组：目的基因和内参基因5两种相对定量的方

2、法比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法样本间的倍数关系6如何选择相对定量的方法？A-F=ΔCt1AFB对应点相减GCCtHD目的基因IE内参基因J[Template]7如何选择相对定量的方法？A-F=ΔCt对应点相减1B-G=ΔCtA2C-H=ΔCt3FBD-I=ΔCt4E-J=ΔCt5GCCtHD目的基因IE内参基因J[Template]8如何选择相对定量的方法？在Excel中制作图表A-F=ΔCt1ΔCtB-G=ΔCt2C-H=ΔCt3ΔCt1ΔCt2ΔCt3ΔCt4ΔCt5D-I=ΔCt4E-J=ΔCt512345稀释点9如何选择相对定量的方法？根据斜率

3、选择一种定量方法︱斜率︱≤0.1比较Ct(ΔΔCt)法︱斜率︱≥0.1相对标准曲线法10ΔΔCt法11ΔΔCt法的必要条件两个基因(目的基因和内参基因)必须有相一致的扩增效率，并尽可能接近100%!12ΔΔCt法如何确认扩增效率每对引物一条标准曲线13实际实验中如何快速判断扩增效率是否一致同时扩增目的基因和内参基因，通过查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确定扩增效率是否相似。14指数增长期的曲线平行说明扩增效率相似内参基因目的基因15ΔΔCt法结果计算步骤1:内参基因均一化样本差异Ct目的基因–Ct内参基因=DCt步骤2:其他样本和对照样本比较DCt处理样本–

4、DCt对照样本=DDCt步骤3:使用公式计算倍数变化=2-DDCt16目的基因和内参基因扩增效率不一致•另一个选择:预先确定每个基因的扩增效率…17目的基因和内参基因扩增效率不一致•分析时，手动输入每个基因的扩增效率相对定量结果计算就会把每个基因的扩增效率计算进去18ΔΔCt实验示例目的基因对照样本内参基因timet=0t=12t=24t=48totalRNAtotalRNAtotalRNAtotalRNAcDNAcDNAcDNAcDNA19ΔΔCt实验示例我们来算一下基因表达变化DRnt=0DRnt=12hCt=23Ct=30CyclesCt=22Ct=27

5、CyclesDRnt=24hDRnt=48hCt=24Ct=26CyclesCt=23Ct=33Cycles内参基因目的基因20ΔΔCt实验示例结果计算SampleCtCtΔCtΔΔCtFolddifferenceinPlat1Plat1GAPDHPlat1CtΔCttreatedrelativetoAverageCtAverageCt－－untreatedGAPDHCtΔCtuntreatedTime=0hr30.4923.636.860.001.0Time=12hr27.0322.664.37-2.505.6Time=24hr27.0623.203.86-

6、3.008.0Time=48hr32.8323.019.822.960.1321相对定量结果8.0875.66t=0t=12h5t=24h4t=48h3GeneExpression210.131Calibratort=022软件计算为你完成所有的计算!23相对标准曲线法24如何选择相对标准曲线的标准品?•任何数量充足，并表达目的基因和内参基因的浓度较高cDNA•只需知道稀释倍数,不需要知道浓度•养成好的制作标准曲线的习惯25每对引物做一条标准曲线18sInsulin10,0006420.6UntreatedCt4171.410,000202.3TreatedC

7、t1000100074.6100TreatedCt100UntreatedCt10101CtCt1RelativeQuantityRelativeQuantity26计算举例Insulin18sNormalizedQUntreatedQ74.6÷6420.60.0116avg.TreatedQ202.3÷4171.40.0484avg.选择一个对照样本：例如,UntreatedUntreated÷Untreated:0.0116÷0.0116=1Treated÷Untreated:0.0484÷0.0116=4.2表达倍数差异27软件计算为你计算好所有的倍数关

8、系28两种方法的区别?比较Ct(ΔΔC