成纤维细胞培养.doc

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1、成纤维细胞培养人皮肤成纤维细胞库的构建试剂:胶原酶(Sigma),优质胎牛血清(Gibco),胰蛋白酶(Sigma),中性蛋白酶(Sigma),DMEM培养基(Sigma),二甲基亚砚(Merck)。方法:乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用D—Hanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标木5遍，直至标木发白，轻度发胀；在培养1111中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成0.3cmx2.Oem大小的皮条，置于培养皿中，加0・25%胰蛋白酶浸没组织，4°C冰箱中消化14-16h,以用眼科银能轻轻揭下表皮为度；消化后的标本置于超净工作台上。吸出胰蛋白酶，用DME

2、M漂洗2遍，中止胰蛋白酶消化作用；用眼科锡轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真皮置于培养11J1中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0.IcmxO.lcmxO.lcm),加入0.2%胶原酶浸没组织，37°C孵箱中消化l~4h,以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；加D-Hanks平衡盐液1500#min离心5min,5遍，以洗去胶原酶，沉淀即为成纤维细胞，弃上清，加DMEM制成细胞混悬液，接种至50ml培养瓶屮，置37°C、5%CO：、湿度95%的CO孵箱中培养131。24h后更换培养基，以后更换培养液1次/3d,大约7~9d左右长满后

3、传代。成纤维细胞的传代:倒掉培养瓶内旧培养液，向培养瓶内加入0.25%的胰蛋白酶2mlo轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所冇细胞表面，然后倒掉消化液后再加入2ml新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。消化约2—5min后把培养瓶放置显微镜下观察，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入DMEM2ml终止消化，用吸管反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。按3传代至新的培养瓶中，置37°C、5%C0、湿度95%的C02孵箱中培养，约3~5d左右可再次传代。成纤维细胞的冻存与复苏:用0.25%的胰蛋白酶2ml消化、分散接近长满单

4、层的成纤维细胞，当胞质冋缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入DMEM6ml终止消化，轻轻吹打细胞。以使细胞游离，1500r/min离心5min,去除胰蛋白酶及I口的培养液，将细胞重悬于配制好的含冇10%无菌二甲基亚飒DMEM冻存液屮，然后分装入无菌塑料冻存管屮，每支冻存管加液l-2ml,封闭冻存管，标明细胞的名称、代数及冻存日期，先将冻存管置于4°C冰箱中保存2h,—20°C冰柜中保存2h,-80°C超低温冰柜中保存2h,即可迅速投入一196~C长期保存。复苏时，将冻存管从液氮中取出，迅速置于37°C水浴中复温，加入8ml培养液，混合后1OOOr/min离心5min,倾去

5、上清液，再加入lOrnl培养混悬，重复低速离心5rain,以除去二甲基亚砚，用新鲜培养液重悬细胞，用培养液适当稀释，使细胞接种密度为lxllY/ml,接种培养瓶，置37°C、5%C0、湿度95%的CO培养箱内培养，待细胞贴壁后更换培养液。最后，将成纤维细胞在倒置显微镜下直接观察其细胞形态，并摄相。换液注意事项：贴壁细胞换液的吋候是从培养瓶的非细胞附着面加PBS（避免影响细胞贴壁），然后轻轻晃动瓶子，从非细胞附着面倒出PBS（也可以吸出来,以免弄湿瓶口)，洗的次数以镜下视野比较干净为准(只要你加pbs不是太少，一般2次左右就洗干净了)，一般不需要吹打，尤其是在你刚传了代或

6、者细胞贴壁能力不是很好的情况下细胞的换液(1)从培养箱屮取出培养瓶，观察细胞。内容冇：①培养瓶中培养液的PH值。%1培养瓶中液体是否澄清。%1倒置显微镜下细胞的生长状态。(2)翻转培养瓶，使贴冇细胞的一面瓶壁向上，并使培养瓶口斜向上倾斜约45。，开瓶盖，用酒精灯的外焰烧瓶口消毒。玻璃瓶瓶口先有雾气生成，等瓶口再次透亮即可。一次性使用的培养瓶只需将瓶口过火即可。(3)长滴管吸取培养液，放入废液缸中。(4)新吸管吸5ml培养液加入细胞瓶。(5)关瓶盖。瓶盖拧紧后向回拧半圈，以利于C02进入。完成实验记录。