应用噬菌体随机肽库技术筛选戊型肝炎病毒中和表位模拟肽.pdf

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1、!"卷#期生物工程学报’()*!"+(*#$%%&年!!月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12+(,-./-0$%%&!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!应用噬菌体随机肽库技术筛选戊型肝炎病毒中和表位模拟肽顾颖张军王颖彬李少伟杨海杰罗文新夏宁邵"（厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室，厦门&#!%%2）摘要以识别戊型肝炎病毒（C9’）构象依赖性中和表位的单克隆抗体3D!!、3C&作为固相筛选分子，对噬菌体随机E肽库进行6轮筛选后，随机挑取单克隆噬菌体进

2、行测序。合成优势E肽序列基因，将其插入CFBG?GGE313&位置之中，进行原核表达，所获重组蛋白经蛋白印迹实验证实可与相应单抗结合，电镜下可见重组蛋白能形成与CFBG?相似的类病毒颗粒。化学合成单抗3C&筛选出的优势E肽，所获E肽经生物传感器结合实验证实与单抗3C&结合。这些结果提示用噬菌体E肽库可以筛选出部分模拟构象性表位的短肽，为亚单位疫苗的研制提供了新的思路。关键词戊型肝炎病毒，中和表位，噬菌体肽库中图分类号H2!#文献标识码G文章编号!%%%1&%#（!$%%&）%#1%#3%1%#戊型肝炎（C9）是一种由C9’引起的经消化道!材料与方法传播的急性散发型肝炎，约占

3、我国急性散发型肝炎［!］的!2IJ$%I。C9’是一种无包膜二十面体对!"!单克隆抗体称结构的病毒，其基因组为EK2L/左右的单链正义抗C9’中和性单克隆抗体3D!!、3C&由本实验［6，2］M+G，包含了&个开放读码框（NM4）。其中NM4!编室制备。码的!#"&个氨基酸的多肽，可识别甲基转移酶、木!"#单抗模拟肽的筛选瓜酶样蛋白酶、解旋酶、M+G依赖的M+G聚合酶，此噬菌体随机E肽库及受体菌3*0(,#9M$E&3购外还存在碱基配对的超变区域；NM4$编码的##%个于美国+-O9;?)7;AF:(P7/<公司。其生物淘洗操作氨基酸的多肽，为病毒主要结构蛋白，组成病毒衣按

4、使用手册的要求进行，大致如下：将单克隆抗体壳；NM4&编码的!$&个氨基酸的小肽。C9’NM4$3D!!、3C（&!%%!?Q.P）分别包被在微孔板上，用$I［$］编码的结构蛋白中含有保护性表位。最近我们在胎牛血清白蛋白（FRG）封闭后，将噬菌体肽库原液大肠杆菌中表达了一个具有很强免疫保护性的!S!%稀释后加入微孔中，室温静置!T；UFR5（含C9’NM4$重组蛋白+9$，并从+9$免疫后的单克%K!I5O--;$%）洗涤!%遍；用!%%!P!%..()QPV)W1D)隆抗体中筛选出了两个中和单抗3D!!和3C&，分别（XC$K$）洗脱结合的噬菌体，室温轻微震荡!%.:;；

5、［&JE］识别病毒衣壳表面的$个构象依赖性表位。本加入!2（XC"K!）中和洗脱液，并!P!.()QP50:<1CD)研究利用噬菌体随机E肽库筛选C9’中和单抗将噬菌体洗脱液接种到$%.P新鲜培养的3*0(,#3D!!和3C&所识别表位的模拟肽，并利用乙型肝炎9M$E&3培养液中，&EY振荡培养6K2T，6Y2%%%0Q核心抗原（CFBG?）作为短肽表位的展示载体，结合.:;离心!2.:;，收集上清，加入!Q#体积的聚乙二合成肽技术验证模拟肽的活性，为C9’亚单位疫苗醇（U9V）Q+7D)溶液（$%IU9V3%%%，$K2.()QP+7D)），的研制奠定基础。混匀后6Y沉淀

6、过夜。6Y!%%%%0Q.:;离心$2.:;，用!.PUFR重悬沉淀，收集扩增后的噬菌体，并按照上述方法用U9VQ+7D)再次沉淀提纯噬菌体，最终收稿日期：$%%&1%21$&，修回日期：$%%&1%31$!。基金项目：福建省科技重大项目（+(*$%%$4%!&），教育部跨世纪优秀人才培养计划。"通讯作者。5-)：3#12"$1$!36!!%；478：3#12"$1$!36!!%；91.7:)：;<8:7=>:;?8:7;*8.@*-A@*B;F期顾颖等：应用噬菌体随机肽库技术筛选戊型肝炎病毒中和表位模拟肽FB8用!""重悬沉淀，’(保存。按常规方法滴定!#$%&洗脱液中噬

7、菌体。将包被用单抗的浓度降低至)"!*+,#，同时把洗涤用$%&-中-.//0!"的浓度提高到"1)2，按上述步骤再淘洗3次。经过’次淘洗后，随机挑取各单抗筛选出的单克隆蓝色噬菌斑，提取单链456测序。783单链456抽提纯化试剂盒购于上海华舜生物工程有限公司。基因测序由上海博亚公司完成。!"#模拟肽重组表达载体的构建重组表达载体9:8’;<,=>为本实验室所构建。该载体利用?%@6*的668<8’;可以在大肠杆菌中以颗粒的形式表达，同时?%@6*的66AB