小豆抗病相关基因VaAC1的克隆与表达分析-论文.pdf

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1、南京农业大学学报2013，36(1)：19—23http：／／nauxb．njan．edu．anJournalofNanjingAgriculturalUniversitydot：10．7685／j．issn．1000-2030．2013．01．004陈新，陈华涛，万建民，等．小豆抗病相关基因VaAC1的克隆与表达分析[J]．南京农业大学学报，2013，36(1)：19—23小豆抗病相关基因的克隆与表达分析陈新，陈华涛，万建民，翟虎渠(1．南京农业大学农学院，江苏南京210095；2．江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏南京2100

2、14)摘要：利用简并引物从小豆中扩增出1条与植物几丁质酶基因高度同源的片段，命名为VaAC1，通过RACE技术延伸VaAC1基因的3端和5端，基因完整ORF长度为885bp，编码294个氨基酸，拥有几丁质酶蛋白家族典型保守结构域GH18一chitinase—like。RT—PCR分析表明，VaAC1基因在小豆根、茎和叶中均有表达，且在叶中的表达相对较高；大豆花叶病毒处理后，VaAC1基因在叶中的表达量显著增强，显示小豆VaAC1基因与病毒病密切相关。关键词：小豆；基因克隆；VaAC1基因；表达分析中图分类号：$431．12文献标

3、志码：A文章编号：1000—2030(2013)01—0019—05CloningandexpressionanalysisofadiseaseresistantgeneVaAC1inadzukibeanCHENXin，CHENHuatao，WANJianmin，ZHAIHuqu(1．CollegeofAgriculture，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China；2．InstituteofVegetableCrops，JiangsuAcademyofAgricultu

4、ralSciences，Nanjing210014，China)Abstract：Inthisstudy，achitinasehomologuegenewasclonedusingdegenerateprimersinadzukibean，andthegenewasnamedVaAC1．The3endand5endsequencesofVaAC1genewereextendedbyRACEmethod．Asaresuh，thecompleteORFofVaAC1genewas885bp，encoding294aminoacids

5、．VaAC1hadatypicalconserveddomainGH18chitinase·likeofthechitinaseprotein一family．ExpressionsofVaACIgeneweredetectedinroot，stemandleafusingRT—PCRmethodinadzukibean，andtheexpressionofVaAC1geneinleafwashigherthaninrootandstem．TheexpressionofVaAC1geneinleafwassignificantly

6、enhancedafterSoybeanmosaicvl,rH,$treatment，whichrevealedthecloserelationshipbetweenVaAC1geneandvirusdiseaseresistanceinadzukibean．Keywords：adzukibean；genecloning；VaAC1gene；expressionanalysis几丁质酶基因在植物中的表达受到真菌、细菌和病毒的强烈诱导，是一种重要的抗病基因⋯。植物几丁质酶基因的研究最早见于菜豆，Broglie等通过原位差异杂交法获

7、得了首个菜豆几丁质酶基因，目前已经从水稻、玉米、小麦等重要农作物中克隆出几丁质酶基因3J。将几丁质酶基因用于创制转基因抗性材料的尝试已经在多种作物中进行，并得到了很好的结果J。根据结构特征，植物中的几丁质酶基因可以分为6大类，不同种类几丁质酶基因的表达在抗病过程中所起的作用以及亚细胞定位是不同的，N型和V型几丁质酶定位于液泡内，而其他类型的几丁质酶位于胞质体外。目前鲜有小豆几丁质酶基因研究的相关报道，本研究利用菜豆等植物中已经报道的几丁质酶基因的保守序列设计简并引物，从小豆中克隆出1个Ⅲ型几丁质酶基因VaAC1，研究了VaAC1

8、基因的表达特性，探讨了VaAC1基因在抗真菌病害和病毒病应用方面的潜力。1材料与方法1．1材料抗病毒病材料小豆(VignaangularisOhwi&Ohashi)资源JS0056，由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供。大肠杆菌菌株DH5ot为笔者所在实验室保存。S