重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定-论文.pdf

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1、蚌埠医学院学报2014年7月第39卷第7期841[文章编号]1000—2200(2014)07-0841-05·基础医学·重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定李见，王露，李玉云[摘要]目的：构建重组表达人吲哚胺2，3-过氧化酶(IDO)基因的慢病毒载体。方法：设计相应引物，从含有人IDO基因的cDNA文库中，利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取人IDO基因的全长编码区片段。将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC—FU进行定向的连接，将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定，并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞，荧光

2、显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况；采用Westerblot检测IDO．GFP融合蛋白的表达情况；实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。结果：成功获取人IDO基因编码区序列，人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确；293T细胞中产生慢病毒颗粒；IDO基因在细胞内稳定表达；人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2x10TU／ml。结论：成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体，为下一步转染目的细胞奠定了实验基础。[关键词]基因表达；吲哚胺2，3-过氧化酶；慢病毒载体；293T细胞[中国图书资料分类法分类号]Q343．1；R556．5[文献标志码]AConstr

3、uctionandidentificationoftherecombinationLentiviralvectorwitllhumanIDOgeneLIJian，WANGLu，LIYu．yun(．ClincialLaboratoryScienceCentre，2．DepartmentofClinicalLaboratoryDiagnostics，BengbuMedicalCollege，BengbuAnhui233030，China)[Abstract]Objeetive：Toconstructtherecombinationlentiviralexpressingvector

4、withhumanIDOgene．Methods：Thefull-lengthcodingregionfragmentofIDOwasamplifiedbyprimerdesignedbythecDNAlibraryincludingIDOgeneusingpolymerasechainreaction(PCR)．ThetargetgenewasdirectlyinsertedintothepGC—FUlentiviralvector，whichweretransformedintotheBacteriumcoliDI-I5ctcells．Thepositiveclonewas

5、identifiedbyPCRandsequencing．Therecombinantlentiviralvectorandpackagingplasmidsphelper1．0andpHelper2．0wereeotransfectedinto293Tcells．Theexpressionofgreenfluorescentprotein(GFP)wasobservedtoevaluategenedeliveryeficiencybyfluorescencemicroscope．ThelevelsoffusionproteinIDO—GFPexpressionweredete

6、ctedbyWesternBlot，andthetitersoflentiviralweredeterminedbyReal—timePCR．Results：TheencodingsequencesofIDOweresuccessfullyobtainedbytheanalysisofPCR，therecombinationlentiviralvectorwithhumanIDOgenewassuccessfullyconstructed，andtransfectedinto293TcellstoexpressIDO．Thetiteroflentiviruswas2×10。TU

7、／m1．Conclusions：Therecombinantlentiviralvectorwithhightiterissuccessfullyconstructed，whichcanprovidethebasisofthefutureexperiment．[Keywords]geneticexpression；indoleamine2，3-dioxygenase；lentiviralvector；293Tcell吲哚胺2，3一过氧化酶(indoleamine2，3一dioxygenase