建立同时分离培养小鼠肝细胞及肝星状细胞的技术-论文.pdf

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1、现代生物医学进展www．shengwuyixue．comProgressinModernBiomedicineVoL14NO．16JUN．2014·3033·doi：10．13241~．cnki．pmb．2014．16．009建立同时分离培养小鼠肝细胞及肝星状细胞的技术李海媛王雪时永全韩英△(第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学重点实验室陕西西安710032)摘要目的：建立一种简便、经济、高产的同步分离培养肝细胞以及肝星状细胞的方法。方法：在参照国内外方法的基础上加以改良，首先采用肝脏原位胶原酶灌注消化的方法，

2、获得总细胞悬液，经多次低速离心分离肝细胞；再用Nycodenz作为分离介质，通过密度梯度离心法从非实质细胞中得到肝星状细胞。通过台盼蓝染色方法鉴定细胞的活力，用倒置相差显微镜、立体显微镜、CK．18、白蛋白免疫荧光细胞化学染色对培养的肝细胞形态以及功能进行检测。使用Desmin、o【一SMA免疫荧光细胞化学对肝星状细胞进行鉴定。结果：成功的在体外同步分离、培养肝细胞及肝星状细胞，肝细胞产率为5—6×107／只小鼠，两只小鼠肝星状细胞产率达lxlO个。细胞存活率及纯度均可达90％。肝细胞在培养24h后呈不规则铺路

3、石样形态，此为典型的肝细胞形态，其标志分子CK．18以及白蛋白免疫荧光染色阳性。倒置相差显微镜下可见贴壁后的肝星状细胞呈典型的星形细胞形态，且其标志分子Desmin、—SMA免疫荧光染色阳性。结论：改良的原位灌注以及分离方法可以同时分离并且培养具有高活性和功能的肝细胞和肝星状细胞。关键词：分离方法；小鼠；肝细胞；肝星状细胞中图分类号：Q95—3；R575．2；Q813；R一331文献标识码：A文章编号：1673—6273(2014)16—3033—05EstablishaTechnologyoflsolatin

4、gandCulturingMouseHepatocytesandHepaticStellateCellsSimultaneously*LIHai-yuan,WANGXue,SHIYong-quan,HAN(StateKeyLaboratoryofCancerBiology,XijingHospitalofDigestiveDisease,TheFourthMilitaryMedicalUniversitY,Xi'an,Shaanxi,710032,China)ABSTRACTObjective：Toestabl

5、ishasimple，economicalandhigh—eficiencytechniquetoisolateandcul~arethemousehepatocytesandhepaticstellatecellscoinstantaneous．Methods：Insitucollagenaseperfusionofliverwasperformedforthetotalcellsuspensionandthenrepeatedlow—speedcentrifugationwasusedforthesepar

6、ationofhepatocytes．Hepaticstellatecellscouldbeobtainedfromnon-parenchymalcellsbydensitygradientcentrifugationusingNycodenzasaseparationmedium．CellviabilitywasidentifiedbyTypanstaining．Theinvertedphasecontrastmicroscope，stereoscopicmicroscopeandimmunofluoresc

7、encestainingofCK一18andalbuminwereusedtodeterminethemorphologyandfunctionofhepatocytes．Immunofluorescencestainingofdesminand一SMAwereusedtodeterminedhepaticstellatecells．Results：Hepatocytesandhepaticstellatecellswereseparatedsynchronouslyandculturedinvitro．5-6

8、X10hepatocyteswereharvestedpermouseandtheyieldofhepaticstellatecellswas1×10orsopertwomice．Bothcellviabilityandpuritycouldreach90％．Afterincubationfor24h，hepatocytespresentedtypicalirregularcobble