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时间:2020-05-07
《乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立-论文.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、·464·国际检验医学杂志2014年2月第35卷第4期IntJLabMed,February2014,Vo1.35,No.4·检验技术与方法·乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立何紫琪,李从荣△,童永清(武汉大学人民医院检验科,武汉430060)摘要:目的建立一种采用Lightcycler系统进行HBVDNA实时荧光定量PCR的方法,并探讨其临床应用价值。方法针对HBV基因组S区设计一对扩增引物,并通过预实验严格优化反应体系的组成和条件;将T栽体与HB"RT区扩增后纯化的产物进行连接反应,然后转染大肠杆菌(DH5a),经蓝、白斑筛选后挑取阳性茵落,提取
2、质粒,制备外标准品。结果用于制成外标准品的质粒经1:1O的缓冲液倍比稀释,制作标准曲线,线性方程为:y一一3.344X+37(P。一0.9999);通过检测已知浓度并经倍比稀释的HBVDNA,表明其最低检测限为5×10IUVmL;拷贝数介于5×1O~5×10IU/mI之间的HBVDNA浓度与ct值具有良好的线性关系。结论外标法实时荧光定量PCR是一种定量相对准确、灵敏度高、特异性强、操作相对简便的方法;该方法可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药;联合该法与血清标志物检测,可更准确评价HBV感染者病情。关键词:肝炎病毒,乙型;聚合酶链反应;质粒DOI:1
3、0.3969/j.issn.1673—4130.2014.04.035文献标识码:A文章编号:1673—4130(2014)04—0464—03EstablishmentoffluorescencequantitativepolymerasechainreactionassayforHBVDNAdetectionHeZiqi,LiCongrong,TongYongqing(DepartmentofCHnicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)Abstract:
4、0,bjectiveToestablishahighsensitiveandreproductivereal-timePCRassayforquantificationofHBVDNAusingtheLightCyclerSystem.MethodsApairofprimersweredesignedtargetingSareainHBVgenome,andthereactionconditionandcomponentoftheamplificationsystemhavebestrictlyoptimizedbypre—experiments.Aligat
5、ionreactionwasmadebetweenvectorTandtheamplificationandpurificationPCRproductofHBVreversetranscriptase,thenthecompetentK.eoli(DH5~)weretrans—fectedbytheligationproduct.Thepositiverecombinant—clonecouldbeoptionedthroughblue-whkeselection.Thentheplasmidswereextractedandmadeintoexternal
6、standardsubstance.ResultsStandardcurvewasmanufacturedusingserialdilutionsofHBVgenomicDNAofknownconcentrations。andthelinerequationandcorrelationcoefficientwasY=一3.344X+37and0.9999re—spectively.Itturnedoutthatthelowerlimitofdetectionwas5×10IU/mLwithagoodlinearcorrelationrangeingin5×10
7、一5×10IU/mL.ConclusionExternalstandardreal—timePCRisamethodthatisrelativelyaccurateinquantitativeanalysis,highlysen—sitive,specificandconvenientinhandling.Keywords:hepatitisBvirus;polymerasechainreaction;plasmidHBV属于嗜肝DNA病毒科的双链DNA病毒,它可引起CTCAAGGTCGGTCGTT4GACA-3;一对HBVS区特异急、慢性肝炎。据世界卫生组织
8、统计,全球约有2O亿人感染引物,扩增区
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