根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化研究.doc

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1、根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化研究　　摘要：以小麦栽培品种郑麦９０２３成熟胚半胚愈伤组织作为受体材料，通过农杆菌菌株ＧＶ３１０１将目的基因导入受体材料并对转化过程进行了优化。考查了ＭＳ培养基中ＮＨ４ＮＯ３浓度对组织培养的影响，以及高渗处理对转化过程的作用。结果显示，２．５倍的ＮＨ４ＮＯ３浓度可明显提高愈伤组织再生率，高渗处理对愈伤组织再生率的提高也有帮助。经抗性筛选和ＰＣＲ鉴定，共得到了４株转基因小麦植株，平均转化效率为０．１８％。　　关键词：小麦；成熟胚；农杆菌；转化　　中图分类号：Ｓ５１２．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114

2、17－3637-03　　　　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＷｈｅａｔＭａｔｕｒｅＥｍｂｒｙｏＴｉｓｓｕｅｓ　　　　ＬＩＹａｎ－ｃｈｕａｎ　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄbyAgrobacteroumstrainGV3101ｕｓｉｎｇｅｘｐｌａｎｔｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｗｈｅａｔｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏｓｏｆＺｈｅｎｇｍａｉ９０２３ａｓｒｅｃｅｐｔｏｒ；ａｎｄｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓ

3、ｓｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＮＨ４ＮＯ３ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｏｓｍｏｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ2.5timesｏｆＮＨ４ＮＯ３ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍａｎｄｏｓｍｏｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔｃouldｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆcallus．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＰＣＲidentification，４ｔｒａｎｓｇｅｎｉ

4、ｃｗｈｅａｔｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｖｅｒａｇｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙof０．１８％．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｗｈｅａｔ；ｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　　　　１９９７年，Ｃｈｅｎｇ等［１］首次用农杆菌介导法获得可育的转基因小麦植株。几年后，夏光敏等［２］、叶兴国等［３］也分别报道利用农杆菌法获得了转基因小麦植株。随后越来越多的研究机构对农杆菌介导的小麦遗传转化方法作了更加细致与深入的研究［４－８］，使得该方法的转化效率不断提高。但上述报道

5、大多用小麦幼胚及其诱导产生的愈伤组织作为转化受体，虽然小麦幼胚再生能力强，但取材在时间和空间上受到很大限制，适宜转化的生理状态难以掌握，转化周期也比较长。相比幼胚，成熟胚取材方便，生理状态一致，不受生长季节限制，是组织培养和遗传转化理想的外植体。本研究以小麦成熟胚诱导的愈伤组织为转化受体，在已有研究基础上［９－１１］选择根癌农杆菌介导小麦遗传转化的几个重要影响因素，进行比较与优化，旨在为进一步建立和优化根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化体系奠定基础。　　１材料与方法　　１．１试验材料　　小麦品种郑麦９０２３以及质粒ｐＴＲＡｋｃ－ＢＡＲ－ＵＴ－

6、Ｒｓ－Ｄ２和根癌农杆菌ＧＶ３１０１均由华中农业大学麦类分子生物学实验室提供。　　１．２试验方法　　１．２．１培养基诱导培养基含ＭＳ基本培养基［１２］、肌醇１００ｍｇ／Ｌ、天门冬氨酸１３４ｍｇ／Ｌ、脯氨酸１１５ｍｇ／Ｌ、ＭＥＳ１．９５ｇ／Ｌ、２，４－Ｄ２ｍｇ／Ｌ、麦芽糖４０ｇ／Ｌ、植物凝胶５ｇ／Ｌ；同时设计了３种ＮＨ４ＮＯ３浓度修饰的诱导培养基。浸染培养基、分化筛选培养基、生根筛选培养基及生根壮苗培养基等参照文献配制［９，１３］。　　１．２．２种子表面消毒及预处理选取成熟饱满、颜色和大小相对一致的小麦成熟种子，用７０％的乙醇浸泡５ｍｉｎ，无菌水

7、冲洗２～３次，再经０．１％ＨｇＣｌ２浸泡１５ｍｉｎ，无菌水冲洗６～８次后，置于含８ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ溶液的无菌三角瓶中３３℃浸泡５ｈ。预处理后的种子用７０％的乙醇浸泡１ｍｉｎ，无菌水冲洗２～３次，再经０．１％的ＨｇＣl２浸泡５ｍｉｎ，无菌水冲洗３～４次。　　１．２．３愈伤组织的诱导用左手拿镊子夹住已浸泡过的成熟种子无胚的一端，右手拿手术刀将成熟胚纵切成两半后，将胚剥出，切面向下放置于诱导培养基上，℃暗培养１４ｄ。　　１．２．４农杆菌接种菌液的准备挑取含目的质粒的农杆菌ＧＶ３１０１单菌落于１０ｍＬ含２５ｍｇ／Ｌkan、１００ｍｇ／Ｌrｉｆ和１０

8、０ｍｇ／Ｌcａｂ的ＹＥＢ培养基中，２８℃、２２０ｒ／ｍｉｎ暗培养过夜。吸取１ｍＬ培养物转入５０ｍＬ含２５ｍｇ／Ｌkan、１００ｍｇ／Ｌrｉｆ和１００ｍｇ／Ｌcａｂ的