质粒DNA测定-实验报告.doc

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1、生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1.掌握PCR基因扩增的原理和操作方法2.掌握碱裂解法提取质粒的方法3.了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引

2、物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。2.质粒DNA的提取与制备(1)碱裂解法：染色体DNA与质

3、粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。(2)离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的

4、吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8DNA纯净A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8含RNA杂质，用RNA酶去除。3.质粒DNA的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA

5、序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。4.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、材料与方法：以流程图示意（一）实验材料：1.PCR仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌液：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基

6、因CHD5片段的pMD18-T)、无菌去离子水、2×PremixTaq、引物2.质粒DNA的提取与制备仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管材料：溶液P1（S1）、溶液P2(S2）、溶液P3（S3）、去蛋白液PE（W1）、漂洗液WB（W2）、洗脱液EB（Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α3.质粒DNA的定量（紫外分光光度法）仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ4.质粒DNA的酶切鉴定仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪材料：无菌水、10×M酶切缓冲液BufR、质

7、粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液（二）实验方法：1.实验流程：简述实验内容流程，PCR操作步骤↓煮菌，PCR（PCR程序最后设4℃保温）↓PCR仪运行约2小时↓学习PCR原理、质粒DNA提取和酶切原理质粒DNA提取（约1小时）↓酶切操作↓保温约1~2小时↓学习紫外检测定量原理、琼脂糖电泳原理紫外检测定量↓电泳上样（样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，Marker）↓电泳仪运行约

8、30分钟观察电泳结果、记录、拍照、保存2.实验步骤1）PCR反应①菌体煮沸10分钟，冷冻，室温