胃蛋白酶原Ⅱ单抗制备及夹心ELISA的初步建立.pdf

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1、动物医学进展，2012，33(4)：56—59ProgressinVeterinaryMedicine胃蛋白酶原Ⅱ单抗制备及夹心ELISA的初步建立张红绪，孙青芸，王继创。，李恒思，张怡青，董彩文。，李玉林，刘旺根。，景建洲。，王云龙(1．河南师范大学，河南新乡453007；2．河南生物工程技术研究中心，河南郑州450021；3．郑州轻工业学院，河南郑州450021；4．郑州职业技术学院，河南郑州450121)摘要：制备配对胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)单抗，建立人血清中胃蛋白酶原Ⅱ夹心ELISA检测方法。用胃蛋白酶原Ⅱ免疫Balb／c小鼠，制备免疫脾细胞，与SP2／O融合，用HAT培养

2、基进行筛选培养，间接ELISA检测阳性克隆，对阳性孔进行多次单克隆化，选出效价高、分泌性能稳定的杂交瘤细胞，制备腹水并进行纯化。进行单抗配对，建立胃蛋白酶原Ⅱ双抗体夹心检测方法。获得1D。、1C、2H、2E。等4株杂交瘤，经配对试验，确定1D、2H可作为夹心ELISA检测PGII的单抗。成功制备出配对单抗，初步建立了PGII双抗体夹心ELISA方法。关键词：胃蛋白酶原；单克隆抗体；双抗体夹心ELISA中图分类号：$854．43文献标识码：A文章编号：1007—5038(2012)04—0056—04胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)是胃黏膜分泌的IgG，由河南省生物工程技术

3、研究中心提供；胃癌阳特异性功能酶，人胃蛋白酶原可根据生化和免疫原性血清，由郑州市肿瘤医院提供；胃蛋白酶原Ⅱ检测性特征分为2种不同的胃蛋白酶原亚群口]。在琼脂试剂盒(酶联免疫法)，购于北京美康生物技术研究糖凝胶电泳下，胃蛋白酶原的迁移率由快到慢分为中心；羊抗鼠酶标二抗(HRP—IgG1、HRP—IgG2a、PG1～PG77种同工酶，其中PG1～PG5有共同的HRP—IgG2b、HRP—IgG3、HRP—IgA及HRP—IgM)，免疫原性，合称PGI(又称PGA)；PG6～PG7迁移购于北京中杉金桥生物技术有限公司。速度较慢，合称PGII(又称PGC)。PGI是胃体黏1．2方法膜主细

4、胞分泌，除主细胞分泌外，幽门腺和十二指肠1．2．1小鼠免疫取8周龄～1O周龄Babl／c雌性也分泌PGlI_2j。小鼠3只，将抗原和福氏完全佐剂(cFA)等体积混合，腹腔注射，首次免疫2周后二次免疫，用福氏不胃癌是全球高死亡率的第二大疾病，严重威胁完全佐剂(IFA)与抗原等体积混合。每次100着人类的健康。对胃癌的早发现、早治疗可明显延g／只。二次免疫后10d左右进行抗体效价检测，长胃癌患者的生存期。因此，对胃癌高危人群的预断尾采血、分离血清，采用间接ELISA法检测，用琼测及筛查就显得尤为重要。国内外胃癌标志物的研扩试验进行复检。采用同种未免疫小鼠血清作为阴究已广泛开展并取得了

5、一定的进展。当胃黏膜发生性对照。病变时，血清中PGI、PGⅡ的含量也随之发生改1．2．2胃蛋白酶原Ⅱ抗原单克隆的建立选取产变。据文献报道，血清PG工／PGlI比值可作为胃生高抗体效价的小鼠脾脏B细胞作为融合细胞。融癌高发的预测指标，因此，检测血清PG工、PG11的合前1d制备饲养细胞。采用SP2／o缺陷性细胞株含量对胃癌的筛查及早期诊断具有重要的意义_4]。与脾脏细胞进行融合。融合7d后，采用间接本试验制备配对的PG1I单克隆抗体，为建立PGIIELISA检测融合细胞分泌抗体水平。对高抗体水定量检测ELISA试剂盒奠定基础。平的细胞采用有限稀释法进行细胞株克隆化]，选1材料与方法

6、出细胞状态良好的单克隆株，进行扩大培养，液氮冻1．1材料存。胃蛋白酶原Ⅱ抗原、福氏完全佐剂(FCA)和福1．2．3单抗腹水的制备取12周龄Balb／c雌鼠，氏不完全佐剂(IFA)，购于Sigma公司；酶标兔抗鼠按每只0．5mL、杂交瘤细胞浓度为1×1O个／mL收稿日期：2Ol1-12-16基金项目：河南省科技创新团队和郑州市科技创新团队项目作者简介：张红绪(1955一)，男，河南洛阳人，教授，主要从事哺乳动物消化道肿瘤分子生物学研究。*通讯作者张红绪等：胃蛋白酶原Ⅱ单抗制备及夹心ELISA的初步建立57腹腔注射，1周左右、待产生明显腹水时收集腹水。进行试验。1．2．4单克隆抗体的

7、纯化及测定参考刘晓波j1．2．7初步建立PG1I的双抗体夹心ELISA检测的抗体纯化方法，对收集的腹水进行纯化，采用采用棋盘滴定法嘲，初步确定PG1的双抗体夹心SDS—PAGE鉴定蛋白的纯度。ELISA中包被单抗和自制酶标抗体的最佳工作浓1．2．5单克隆抗体亚型的初步鉴定间接ELISA度，用PG1检测试剂盒检测胃癌阳性血清的PG1测定，以抗原PG1100ng／~L包被酶标板，按行分别含量，作为定值标本，空白孔作为阴性对照。加入筛选出阳性细胞株的培养上清液，37。C温育3O2结果m