DB50∕T 1006-2020 牛肺炎支原体抗体检测方法.pdf

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1、ICS11.220DB50B43重庆市地方标准DB50/T1006—2020牛肺炎支原体抗体检测方法Enzyme-linkerimmunosorbentassayForMycoplasmabovis2020-05-20发布2020-08-20实施重庆市市场监督管理局发布DB50/T1006—2020前言本标准按GB/T1.1-2009进行起草。本标准由重庆市动物疫病预防控制中心提出。本标准由重庆市农业农村委员会归口。本标准起草人:蔺露、曾政、姚璐、董春霞、孙燕、谢建华、陈忠琼、凌洪权、梁望旺、杨泽林、程千川。DB50/T1006—2020牛肺炎支原体抗体检测方法1范围本标准规定了牛

2、肺炎支原体抗体检测方法，利用牛肺炎支原体抗体酶联免疫吸附试验，检测牛肺炎支原体抗体。本方法适用于检测牛血清（血浆）的牛肺炎支原体抗体。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1牛肺炎支原体是指引起牛传染性支原体肺炎（又称烂肺病）以肺部病变为主要特征的传染病的一种支原体。3.2酶联免疫吸附试验简称酶联免疫法，或者ELISA法。将已知的抗原或抗体吸

3、附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。4牛肺炎支原体P39抗原酶联免疫吸附试验4.1试验材料洗液：配制见附录第A.1章；稀释液：配制见附录第A.2章；标准阳性血清：含牛肺炎支原体抗体的牛血清；标准阴性血清：无牛肺炎支原体抗体的牛血清；酶结合物：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗牛IgG；底物溶液：配制参见附录第A.3-A.4章；终止液：配制参见附录第A.5章。4.2操作步骤4.2.1样品准备将被检血清（或血浆）用稀释液（见附录A.2）做1:40稀释。4.2.2加样取出抗原

4、包被板，A1、B1加入100μL阴性对照，C1、D1加入100μL阳性对照，其余孔加入1:40稀释的被检血清（血浆），每孔100μL，将加样位置做好记录，用封膜封板，室温孵育30min。4.2.3洗涤1DB50/T1006—2020吸除孔内液体，每孔加300μL冲洗液（见附录A.1）冲洗，重复5次，在吸水纸上轻拍，确保孔内无残留液体。4.2.4加酶标抗体每孔加入酶标抗体液100μL，以封膜封板，室温孵育30min。4.2.5洗涤洗涤方法同4.2.3。4.2.6加底物每孔加入100μL底物使用液（见附录A.3和附录A.4），室温孵育10min。4.2.7终止加终止液（见附录A.5），

5、100μL/孔，使其终止反应。4.3结果判定设定酶标仪检定波长在450nm（即OD值）；阳性对照均值（PC）＞0.5，阳性对照OD值的均值（PC）与阴性对照均值（NC）的比值＞4，判定实验有效，若两者不成立，则实验无效，需重复；待测样本的判定，S/P值≥0.4者判定为阳性，S/P值＜0.4为阴性样本。SNCS/P=PCNC其中S为待测样本的OD值。2DB50/T1006—2020附录A试剂的配制A.1磷酸盐缓冲液（含0.05%Tween-20的0.01mol/LpH7.4的PBS，即PBST）PBS氯化钠8g磷酸二氢钠0.2g磷酸氢二钠2.9g氯化钾0.2g蒸馏水加至1000m

6、LPBSTTweent-200.5mL加0.01mol/LpH7.4的PBS至100mLA.2稀释液（含0.1%BSA的PBST）牛血清白蛋白(BSA)0.1g加PBST至100mL4℃存放，避光。A.3底物缓冲液柠檬酸0.47g十二水合磷酸氢二钠1.84g蒸馏水加至100mL，pH值5.0-5.4A.4底物使用液TMB(2mg/mL)0.5mL底物缓冲液（pH5.5）9.5mL0.75%H2O242μLA.5终止液浓硫酸11.1mL蒸馏水88.9mL3