毛细管区带电泳高效分离和高灵敏检测α-乳清蛋白和β-乳球蛋白.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第10期2013年l0月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl597～1600DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．30280毛细管区带电泳高效分离和高灵敏检测一乳清蛋白和-乳球蛋白刘一廖一平白玉刘虎威(北京分子科学国家实验室，生物有机与分子工程教育部重点实验室，北京大学化学与分子工程学院分析化学研究所，北京100871)摘要O／一乳清蛋白和哥L球蛋白系由牛乳清提取的乳糖制品中的主要蛋白杂质，是引起食物及药物过敏的主要

2、过敏原。因此，在食品安全及医药安全领域，对二者的分离及痕量检测是至关重要的。本研究建立了一种简单、快速、灵敏、重现性好的毛细管区带电泳(CZE)方法，使用简单的电泳体系和样品处理步骤，实现了O／一乳清蛋白和』B一乳球蛋白的基线分离和痕量检测。CZE条件如下：25mmol／L磷酸盐缓冲液(pH7．0)，分析电压+30kV，毛细管温度25℃，紫外检测波长205rim，压力进样5kPa~10S。在此条件下，样品分析时间为2rain，哥L清蛋白和口一乳球蛋白的检出限(LOD)分别为3．0和12mg／L；迁移时间和峰面积的相对

3、标准偏差(RSD，n=6)分别小于1％和6％，符合实际样品检测要求。本方法已成功用于实际乳糖样品的分析，在相关领域也有很好的应用前景。关键词毛细管区带电泳；乳糖；一乳清蛋白；哥L球蛋白1引言乳糖制品广泛用于食品及医药行业，如婴儿食品、人造奶油及糖果制品等。药用乳糖在医药行业的应用也El益增多，目前普遍作为药用填充剂或稀释剂用于药物生产中。然而，由于乳糖一般从牛奶乳清中提取，常因含有乳清蛋白等杂质而使其纯度降低。这些杂质蛋白的存在使得用药过敏的可能性大大增加，在注射用药中尤为突出。2010版《中国药典》特别增订了对乳糖

4、有关检测的法定标准[5989—81．1]，主要目的是保证药用乳糖中由杂质蛋白引起的过敏反应最小化。由此可见，在制药行业中的乳糖制品安全已经得以充分重视，而在食品行业亦如此。本研究涉及的一乳清蛋白和哥L球蛋白是乳糖制品中的主要杂质，也是主要过敏原。因此，严格控制乳糖制品中二者的含量极为重要。本研究组的前期实验表明，高效液相色谱(HPLC)对二者的分离并不理想，且因紫外检测器的检测限较高而难以真正用于乳糖制品质量控制。目前为止，以HPLC技术对乳清成份的分析往往耗时较长卫J。而其它传统分析方法，如凝胶电泳法_3及免疫法等

5、，均在方法成本、操作简单性或灵敏度方面不太理想。因此，发展一种灵敏、快速、高效的OL一乳清蛋白和哥L球蛋白分离检测方法十分必要。近年来，毛细管电泳(CE)在大分子分离分析领域展现了独特的优势，其在生物领域及食品、药物质量控制领域中的应用也日益广泛。目前使用CE技术进行蛋白分离的最主要问题之一是样品吸附等原因造成的分离性能和检测灵敏度下降J。解决这一问题的手段主要包括采用涂层毛细管¨8I9J、使用极端pH条件、发展高灵敏度的检测方法以及样品的富集等。其中，高灵敏度检测方法主要有电化学检测、荧光检测和质谱(MS)检测方法

6、，而样品富集技术一般可分为柱前富集和柱上富集Hj。通常使用紫外(uv)检测器可达到Ixmol／L量级的检出限_l。而采用样品富集和激光诱导荧光(LIF)检测结合的方法，可使检测限降低至pmol／L—nmol／L水平加’“’HJ。在实际应用中，因uV检测方法简单、仪器普及率高、性能稳定、自动化程度高等优点而广泛使用。目前，蛋白质的高灵敏度检测多采用uV方法，如对牛血清白蛋白(BSA)检出限可达到30pmol／L¨、通过柱前浓缩可实现的对肌红蛋白的2013-03-30收稿；2013-o4—15接受本文系国家自然科学基金(

7、Nos．20805001，21175005)和科技部仪器专项(No．2012YQ090194-9)资助项目E—marl：hwliu@pku．edu．cn分析化学第4l卷1700倍富集H钊等，但这些方法所使用的样品处理步骤都较为复杂。采用简便快速的CE方法对Ot一乳清蛋白和哥L球蛋白进行痕量分离检测至今未见报道。本研究采用毛细管区带电泳(CZE)实现了对Og哥L清蛋白和哥L球蛋白的高效分离及高灵敏检测。通过使用优化的样品处理步骤及实验条件，有效避免了两种蛋白在毛细管内壁的吸附问题，二者峰形良好，在2min内可实现基线分

8、离。将本方法用于两种蛋白测定，线性范围和重现性均能满足要求。该方法已用于实际样品的分析，可成功区分经过一次精制的乳糖粗品和二次精制的乳糖制品，可望在乳糖制品杂蛋白检测领域得到更广泛的应用。2实验部分2．1仪器与试剂Aglient。HPCE毛细管电泳仪(美国安捷伦科技公司)，仪器控制、数据采集与处理由安捷伦化学工作站软件ChemStation(版