流式细胞仪(Flow Cytometer)基本原理.pdf

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1、1、流式细胞术简介流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪（FlowCytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。流式细胞术的特点检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测参数：多参数；检测特点：单细胞水平分析；检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒；检测结果：精度高、准确性好；可对目标细胞

2、进行分选；2、流式细胞术光信号检测光信号的类型散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。前向散射光(forwardscatter,FSC)；侧向散射光(sidescatter,SSC)。荧光信号自发荧光：微弱（核黄素、色素分子等）；特异荧光：荧光素分子发出的的荧光比自发荧光强很多倍。前向散射光FSC激光器正前方1-6度方向上有比较强的衍射光，即前向散射光，FSC强度是d/λ的函数(λ表示波长，d指细胞大小)，所以FSC反映被测细胞的体积大小和活力。侧向散射光SSCSSC方向与激光束和液流形成的平面相

3、垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。散射光的作用实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。粘连死细胞死细胞细胞或碎片肿瘤细胞株FSC/SSC散点图加药处理后FSC/SSC散点图阈值：Threshold/Trigger阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。F

4、SC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。5%32%默认阈值升高阈值后荧光素和荧光信号荧光：荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态，再回到低能态时释放出的光。激发波长发射波长(荧光波长)＜ExcitationwavelengthEmissionwavelength常用荧光素<499nm：蓝色荧光（Blue）；500-549nm：绿色荧光（Green）；550-584nm：黄色荧光（Yellow）；585-615nm：橙色荧光（Orange）；616-700nm：红色荧光（Red）；≥700nm：远

5、红外荧光（Far-Red）。标记抗体的荧光素激发光波长发射光波长荧光素分子中文名（nm）（nm）FITC490520异硫氰酸荧光素PE488575藻红蛋白PerCP490675多甲藻叶绿素蛋白APC650660别藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻红蛋白-花青素5PE-Cy7496/546767藻红蛋白-花青素7AlexaFlour488495519AlexaFlour647650665核酸荧光染料PI（碘化丙啶535,623）可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA

6、对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。7-AAD（7-氨基放线菌素D545,647）以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。Hoechst（343,450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析

7、，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。PY（派若宁560,573）RNA染料，能进入活细胞。AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。4、流式图和流式结果流式数据的存储：列表模式（listmode），记录了每个细胞的所有参数的信息。FL1FL2FL3Event#FSCSSCFITCPEAPC110050010650421105057007006390480720670104954901572015……每个细胞检测5个参数，那么获取1

8、0000个细胞，容量为5×10000（字或双字）。流式数据的显示方式•常用分析软件•单参数直方图(Histogram)–MACSQuantify•双参数数据显示：–CellQuest散点图(DotPlot)伪彩图(Pseudo-colorPlot)–Diva等高线图(ContourPlot)–FlowJo密度